基于免疫層析試紙的豬O型FMDV抗體水平監(jiān)測(cè)

盧清俠，楊繼飛，金前躍，楊蘇珍，柴書軍，萬 博，郝慧芳，張改平

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

口蹄疫(foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口 蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的一種急性、熱性和高度接觸性的烈性傳染病，主要侵害偶蹄獸，偶見于人和其他動(dòng)物，以傳播迅速、感染率高而著稱.一旦發(fā)病極易形成暴發(fā)大流行，發(fā)病率幾乎達(dá) 100%，不易控制和消滅［1～3］.世界上許多國家和地區(qū)都有該病的流行與發(fā)生，嚴(yán)重威脅全球畜牧業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］，因此國際獸疫局(OIE)將其列為A類傳染病之首.FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，有 O，A，C，SAT1，SAT2，SAT3(南非1，2，3 型)以及AsiaⅠ(亞洲Ⅰ型)7個(gè)血清型，彼此間均無交叉免疫保護(hù)，其中中國以O(shè)型為主.許多國家，特別是發(fā)展中國家，目前采取以疫苗免疫為主的綜合性防控措施來預(yù)防和控制口蹄疫［4］.口蹄疫滅活疫苗和弱毒疫苗在以往口蹄疫防治中發(fā)揮了巨大作用，但這些傳統(tǒng)疫苗存在保護(hù)力短效、僅誘導(dǎo)血清型特異性免疫反應(yīng)、疫苗副反應(yīng)嚴(yán)重以及生物安全隱患等問題［5，6］.豬口蹄疫O型合成肽疫苗相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗具有免疫譜廣、免疫持續(xù)期長(zhǎng)、生物安全性好、免疫副作用小等優(yōu)點(diǎn)，能夠很好的預(yù)防豬O型口蹄疫的發(fā)生，得到了較好的推廣應(yīng)用［7～9］.為了便于快速、準(zhǔn)確、高效地評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫保護(hù)水平，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制開發(fā)了豬口蹄疫O型抗體免疫層析試紙，該試紙經(jīng)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清檢驗(yàn)符合要求，并已完成對(duì)大量田間樣品的系統(tǒng)檢測(cè)研究［10，11］.本研究應(yīng)用該試紙對(duì)口蹄疫O型合成肽疫苗免疫的50頭試驗(yàn)豬進(jìn)行抗體水平檢測(cè)，并通過TSR3000讀條儀掃描檢測(cè)線灰度來定量分析免疫豬群首次免疫及2次免疫后抗體水平變化，同時(shí)與UBI生產(chǎn)的豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，評(píng)價(jià)二者的符合率，為豬口蹄疫O型合成肽疫苗防控以及試紙?jiān)u價(jià)體系的建立和推廣應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選用河南省鄭州市某規(guī)?；i場(chǎng)中品種、來源相同的50日齡健康仔豬，共50頭.

1.1.2 儀器 TSR3000讀條儀，購自 Bio-Dot公司;酶標(biāo)儀 M550型，購自 Bio-Rad公司;洗板機(jī)ELx50型，購自Bio-Tek公司.

1.1.3 試劑 豬口蹄疫O型抗體免疫層析試紙，由河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制，批號(hào)為20110609;豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒，為上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品;豬口蹄疫O型合成肽疫苗，為申聯(lián)生物醫(yī)藥(上海)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20110403.

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)豬的選取 品種、來源相同的50日齡健康仔豬分別經(jīng)前腔靜脈逐頭采血，常規(guī)方法分離血清，使用ELISA試劑盒檢測(cè)FMDV抗體，應(yīng)用PCR 方法檢測(cè) PRV，CSFV，PRRSV，PCV2 抗原.選取無 PRV，CSFV，PRRSV，PCV2病原，且無 FMDV母源抗體的50頭健康仔豬進(jìn)行試驗(yàn).

1.2.2 試驗(yàn)豬的免疫 對(duì)50頭試驗(yàn)豬進(jìn)行編號(hào)，參考豬口蹄疫O型合成肽疫苗說明書的免疫劑量免疫接種，首次免疫每頭仔豬1 mL，30 d后加強(qiáng)免疫每頭1 mL.

1.2.3 血樣采集 首次免疫后28 d及2次免疫后20 d分別經(jīng)前腔靜脈逐頭采血5 mL，常規(guī)方法分離血清，用于抗體檢測(cè).

1.2.4 抗體檢測(cè) 試紙的操作按其說明書進(jìn)行，將待檢血清用生理鹽水做100倍稀釋后，取150 μL加入試紙樣品孔中，室溫靜置5～10 min，目測(cè)判斷檢測(cè)結(jié)果.根據(jù)檢測(cè)線的有無來評(píng)價(jià)豬O型口蹄疫抗體.試紙出現(xiàn)2條紅色的線條(檢測(cè)線和質(zhì)控線)時(shí)，無論其強(qiáng)弱均判為陽性，用“+”表示(檢測(cè)線強(qiáng)度越強(qiáng)對(duì)應(yīng)其抗體水平越高);只出現(xiàn)1條質(zhì)控線時(shí)則判為陰性，用“－”表示;質(zhì)控線不出現(xiàn)時(shí)表明操作失誤或試紙失效應(yīng)重新試驗(yàn).加樣15 min后用TSR3000讀條儀掃描試紙檢測(cè)線，對(duì)其灰度值進(jìn)行定量測(cè)定，以檢測(cè)線掃描灰度面積積分值表示.

ELISA試驗(yàn)使用豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒對(duì)血清樣品進(jìn)行口蹄疫抗體檢測(cè)，按其說明書進(jìn)行操作.陽性對(duì)照樣品的OD450平均值×0.23作為臨界值，被檢樣品的OD450值≥臨界值的判為陽性，OD450值＜臨界值的判為陰性.

2 結(jié)果與分析

對(duì)口蹄疫O型合成肽疫苗免疫的50頭試驗(yàn)豬進(jìn)行相關(guān)抗體水平的檢測(cè)結(jié)果見表1.由表1可見，首次免疫后28 d采集的50份免疫血清中，試紙判定結(jié)果為陽性的共計(jì)44份，陰性6份;FMDV VP1抗體檢測(cè)ELISA試劑盒判定樣品OD450值≥臨界值的樣品共計(jì)44份，樣品OD450值＜臨界值的樣品共計(jì)6份，二者的結(jié)果完全一致.2次免疫后20 d采集的50份免疫血清中，試紙及FMDV VP1抗體檢測(cè)ELISA試劑盒判定結(jié)果均為陽性，二者的結(jié)果完全一致.免疫層析試紙與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%.統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果可知，合成肽疫苗首次免疫后28 d抗體陽性率達(dá)88%，2次免疫后20 d抗體陽性率高達(dá)100%.

同時(shí)對(duì)試紙檢測(cè)線灰度值進(jìn)行定量測(cè)定，以檢測(cè)線掃描灰度面積積分值表示(表1)，用以評(píng)價(jià)免疫血清中抗體水平.檢測(cè)線顏色越深，則掃描灰度面積積分值越高.首次免疫后28 d及2次免疫后20 d免疫血清中抗體水平對(duì)比如圖1所示.首次免疫后 28 d 有 6 份樣品 (B04，B06，B30，B36，B43，B45)抗體檢測(cè)結(jié)果呈陰性，2次免疫后20 d，該6份樣品抗體檢測(cè)結(jié)果均呈陽性，且抗體水平均大幅上升.檢測(cè)線掃描灰度面積積分平均值由首次免疫后的155.39大幅上升至2次免疫后256.26，可見經(jīng)第2次加強(qiáng)免疫后不但抗體陽性率上升到100%，而且群體抗體水平整體有較大幅度提升.此外，B01，B12，B26等樣品首次免疫后抗體檢測(cè)結(jié)果雖呈陽性但抗體水平偏低，2次免疫后抗體水平也未顯著提升，分析可能與豬只個(gè)體差異有關(guān).整體而言，2次免疫后豬群免疫抗體水平整體顯著提升，并保持在一個(gè)較高的水平.

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3 討論

國際上預(yù)防和控制口蹄疫的基本策略主要分為2種:以撲殺為主的綜合防制措施和以免疫為主的綜合防制措施.發(fā)達(dá)國家實(shí)行以“撲殺為主、經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償”的綜合防制措施;發(fā)展中國家由于受經(jīng)濟(jì)社會(huì)條件的限制，主要采取以免疫為主的綜合防制措施［4］.中國目前采取以免疫注射為主的綜合性防控措施來預(yù)防和控制口蹄疫，因而快速、高效、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫抗體水平至關(guān)重要［12，13］.傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)疫苗免疫的主要手段有血凝試驗(yàn)、液相阻斷ELISA和固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA，但是這些方法操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，且存在病毒滅活不全和病毒逃逸等危險(xiǎn)［14～16］.為給評(píng)價(jià)體系提供便捷的研究工具，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制開發(fā)了豬口蹄疫O型抗體免疫層析試紙.免疫層析試紙將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起，具有便捷、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，不需借助任何儀器設(shè)備和專門的技術(shù)人員，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)和臨床診斷，成為目前進(jìn)行快速診斷的主要方法之一［17］.

圖1 首次免疫后28 d及2次免疫后20 d抗體水平對(duì)比Fig.1 Comparison of antibody levels between 28 days after primary immunity and 20 days after secondary immunity

近年來，口蹄疫合成肽疫苗憑借其高效廣譜的免疫力、穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已逐步占據(jù)主要市場(chǎng)，推廣應(yīng)用效果顯著.本研究對(duì)口蹄疫O型合成肽疫苗免疫的50頭試驗(yàn)豬進(jìn)行相關(guān)抗體水平檢測(cè).合成肽疫苗首次免疫后抗體陽性率達(dá)88%，2次免疫后抗體陽性率高達(dá)100%，表現(xiàn)出口蹄疫合成肽疫苗良好的免疫原性.同時(shí)，對(duì)試紙檢測(cè)結(jié)果的定量測(cè)定結(jié)果表明，2次免疫后豬群免疫抗體水平整體顯著提升，并保持在一個(gè)較高的水平.對(duì)比河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的豬口蹄疫O型抗體免疫層析試紙和UBI生產(chǎn)的豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒，結(jié)果表明，二者具有相同的敏感性和特異性，符合率為100%.UBI生產(chǎn)的ELISA診斷試劑盒價(jià)格昂貴，國內(nèi)目前尚無可替代的商品化ELISA試劑盒來評(píng)價(jià)動(dòng)物的免疫水平.免疫層析試紙具有快速、準(zhǔn)確、直觀、便于臨床操作等優(yōu)點(diǎn)，更適合用于大規(guī)模檢測(cè)及零散樣品現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，同時(shí)還可以通過儀器掃描滿足定量測(cè)定的要求，用以評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫水平具有廣闊的應(yīng)用前景和價(jià)值［18，19］.

本次試驗(yàn)在規(guī)?；B(yǎng)殖豬場(chǎng)進(jìn)行，切合生產(chǎn)實(shí)際，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中疫苗接種具有指導(dǎo)價(jià)值.本試驗(yàn)對(duì)于試驗(yàn)豬免疫抑制性疾病的細(xì)致排查篩選，對(duì)最終取得良好免疫效果具有重要作用.本次試驗(yàn)僅對(duì)口蹄疫合成肽疫苗的免疫抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)和探討，對(duì)于疫苗的免疫機(jī)理、保護(hù)效力等方面有待深入研究.

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