TSHR和 RASSF1A基因甲基化與乳頭狀甲狀腺癌的相關(guān)性△

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科 (廣州 510282)

戴亞麗 蔡德鴻* 陳 宏 張 振 張 樺 李 靜

腫瘤的發(fā)生與原癌基因激活和抑癌基因失活,并最終引起基因表達(dá)異常有關(guān)?；虮磉_(dá)異?？赡芡ㄟ^基因機(jī)制(Genetic mechanism)和表基因機(jī)制(Epigenetic mechanism)[1]來完成。 DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,對(duì)維持染色體的結(jié)構(gòu)、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生發(fā)展都起重要的作用,主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū) CpG位點(diǎn)[2]。正常組織的腫瘤抑癌基因不發(fā)生甲基化,當(dāng)腫瘤抑癌基因發(fā)生甲基化后,就不能正常轉(zhuǎn)錄、翻譯合成抑癌蛋白及發(fā)揮抑癌作用,細(xì)胞就有可能發(fā)生單克隆增生形成腫瘤。

乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲狀腺最常見的惡性腫瘤,目前國外有研究報(bào)道甲狀腺癌的發(fā)生也與抑癌基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生密切相關(guān)[3],本研究選擇了兩種抑癌基因:促甲狀腺激素受體(Thyroid stimulating hormone receptor,T SHR)和 RASSF1A基因,采用甲基化特異性 PCR(Methylation-specific PCR,M SP)法 ,對(duì) PTC及對(duì)照組織進(jìn)行研究,來探討 PTC的發(fā)生機(jī)制。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 研究組為我院甲乳外科 2007～2009年收治的 50例 PTC患者(PTC組),男 15例,女35例,平均年齡 (40± 12)歲;對(duì)照組為我院甲乳外科同期收治的 32例良性甲狀腺腫瘤患者,其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫 20例,甲狀腺腺瘤 12例;男 9例,女 23例,平均年齡(37±12)歲。兩組均為新鮮手術(shù)標(biāo)本,經(jīng)病理檢查確診,標(biāo)本切除后迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

2 方 法

2.1 組織 DNA的提取:使用 QIAamp DNA Mini Kits 51304基因組提取試劑盒(美國 Qiagen公司)按說明書提取基因組 DNA,紫外分光光度儀檢測(cè)其含量和純度。

2.2 DNA甲基化修飾:使用 Cp GenomeTMDNA Modification Kit S7820(CHEMICON公司 )試劑盒對(duì)提取的 DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理和純化。

2.3 甲基化特異性 PCR(MSP)擴(kuò)增:兩種抑癌基因的甲基化引物與非甲基化引物序列參照文獻(xiàn)[4,5],見表 1,由上海生工公司合成。 PCR反應(yīng)體系 25 μ l,上下游引物各 1 μ l(10pmol/μ l),甲基化修飾后的 DNA 2 μ l,所 用 試 劑 盒 為 2× PCR master mix K0171(Fermentas公司)。 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

兩種抑癌基因 PCR(甲基化與非甲基化)擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 5min,95℃變性 30s,65℃(TSHR基因)/60℃(RASSF1A基因 )退火 30s,72℃延伸 30s,循環(huán) 30個(gè)周期,最后 72℃延伸 5min。

2.4 抑癌基因克隆及測(cè)序:每個(gè)抑癌基因各隨機(jī)選取 2例 PTC及 2例對(duì)照組織(均包含甲基化標(biāo)本及未甲基化標(biāo)本各 1例),首先進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,克隆后再測(cè)序。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,以Pearsoni2檢驗(yàn)分析兩個(gè)抑癌基因 PTC組與對(duì)照組間甲基化差別;PTC組 TSHR與 RASSF1A基因甲基化的相關(guān)性用 Spearman相關(guān)分析;以 Pearsoni2檢驗(yàn)分析 PTC組兩個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化和主要的臨床病理參數(shù)的關(guān)系,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 PCR所用引物序列及片段大小

結(jié) 果

1 兩種抑癌基因啟動(dòng)子甲基化分析:PTC患者中,發(fā)現(xiàn) 34/50例(68.0%)TSHR基因、30/50例(60.0%)RASSF1A基因啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化;對(duì)照組患者中,7/32例(21.9%)TSHR基因、10/32例(31.3%)RASSF1A基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化;PTC組 TSHR基因和 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率均顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖 1,2)。

圖1 TSHR基因啟動(dòng)子 M SP電泳圖(Marker:100bp DN A標(biāo)記物,K、L:PTC組,Y、W:對(duì)照組,U:非甲基化條帶,M:甲基化條帶)

圖2 RASSF1A基因啟動(dòng)子 M SP電泳圖(Marker:100 bp DN A標(biāo)記物,K、L、M、N、O、Q:乳頭狀甲狀腺癌,上排 U、Y、Z:對(duì)照組織標(biāo)本,下排 U:非甲基化條帶,M:甲基化條帶)

圖3 測(cè)序圖(TSHR基因啟動(dòng)子甲基化者 CpG島中的 C仍為 C,未甲基化者 C均轉(zhuǎn)變?yōu)?T)

2 測(cè)序結(jié)果:兩個(gè)基因啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化的,其所有 CpG位點(diǎn)堿基均發(fā)生了改變,即甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物中的 CpG位點(diǎn)的 C仍然保持 C,而非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物中的 CpG位點(diǎn)中的 C轉(zhuǎn)變?yōu)?T(圖 3,4)。

3 PTC組 TSHR和 RASSF1A基因甲基化間的關(guān)系:PTC組織中 TSHR和 RASSF1A基因啟動(dòng)子均甲基化的為 26/50;TSHR甲基化而 RASSF1A基因未甲基化的為 8/50;TSHR未甲基化而 RASSF1A基因甲基化的為 4/50;TSHR和 RASSF1A基因啟動(dòng)子均未甲基化的為 12/50。計(jì)算 r=0.490(P=0.000),提示 PTC組 TSHR和 RASSF1A兩個(gè)抑癌基因甲基化之間存在顯著相關(guān)性。

4 兩個(gè)抑癌基因甲基化與患者臨床病理資料之間的關(guān)系:結(jié)合患者的臨床病理資料,TSHR和RASSF1A基因甲基化與患者的年齡、性別、臨床分期均未見相關(guān)性;TSHR基因與患者是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),RASSF1A基因與患者是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān) ,見表 2。

圖4 測(cè)序圖(RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化者 CpG島中的 C仍為 C,未甲基化者 C均轉(zhuǎn)變?yōu)?T)

表2 兩個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化和主要臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討 論

表基因機(jī)制主要指 DNA 5’CpG島胞嘧啶甲基化改變[1],引起基因表達(dá)異常。腫瘤中 DNA甲基化異常表現(xiàn)為基因中散在的 CpG位點(diǎn)甲基化普遍下降和區(qū)域性 CpG島高甲基化并存及細(xì)胞總的甲基化能力升高。目前人們已在多種腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腎癌、鼻咽癌等)的發(fā)生中證實(shí)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6],有關(guān)甲狀腺腫瘤與抑癌基因甲基化的關(guān)系,國外也有相關(guān)報(bào)道。

Jason等[5]對(duì) 32例 PTC患者和 27例對(duì)照組采用MSP方法進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn) T SHR在癌組織的甲基化率為 34%,在對(duì)照組中為 7%,兩者存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并且在甲狀腺癌組發(fā)現(xiàn)了 TSHR甲基化的腫瘤復(fù)發(fā)率高,未發(fā)生甲基化的腫瘤復(fù)發(fā)率低,他們認(rèn)為抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化是甲狀腺癌的一個(gè)惡性標(biāo)記。Schagdarsurengin等[7]采用 MSP法 ,對(duì) 13例 PTC,10例濾泡型甲狀腺癌,9例未分化甲狀腺癌,6例髓樣甲狀腺癌,12例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及 10例濾泡型腺瘤進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn) PTC患者 TSHR啟動(dòng)子甲基化率為58%,未分化甲狀腺癌為 86%,而在對(duì)照組達(dá)到 80%,T SHR啟動(dòng)子甲基化率僅在未分化癌中較其他甲狀腺癌高。唐建東[8]等用 M SP法在 PTC組織中發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生率為 55.9%(19/34),癌旁組織中甲基化的發(fā)生率為 23.5%(8/34),認(rèn)為甲基化可能與 PTC發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

我們使用 MSP法,檢測(cè)了 50例 PTC和 32例對(duì)照 TSHR和 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化情況,發(fā)現(xiàn)了兩種抑癌基因啟動(dòng)子的甲基化頻率在 PTC中明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);測(cè)序結(jié)果證實(shí)了兩個(gè)基因啟動(dòng)子 CpG島的所有 CpG位點(diǎn)均發(fā)生了甲基化。有研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有協(xié)同作用,多個(gè)抑癌基因甲基化對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響可能較單一基因甲基化更為重要[5]。我們進(jìn)一步對(duì)兩種抑癌基因甲基化之間相關(guān)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)T SHR和 RASSF1A之間存在關(guān)聯(lián)性,這可能是由于兩種抑癌基因的作用環(huán)節(jié)相同:TSHR基因和RASSF1A基因都主要作用于信號(hào)傳導(dǎo)[9]。 PTC組兩種抑癌基因啟動(dòng)子甲基化,均與腫瘤的臨床分期無關(guān),提示兩種抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可能在甲狀腺腫瘤的早期階段既已發(fā)生;但 TSHR基因啟動(dòng)子甲基化率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 PTC高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例,提示該抑癌基因啟動(dòng)子甲基化在甲狀腺癌的惡性進(jìn)展中可能發(fā)揮一定作用。僅從我們的研究結(jié)果表明,在 PTC中兩種抑癌基因啟動(dòng)子的高甲基化可能抑制了抑癌基因的表達(dá),使得抑癌基因?qū)?PTC的抑制作用減少,從而促進(jìn)了 PTC的發(fā)生和發(fā)展,另 TSHR基因和RASSF1A基因在 PTC的發(fā)生中可能起到協(xié)同作用。因此,我們的研究提供了證據(jù):在 PTC中異常的抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可能是抑癌基因沉寂的一個(gè)重要機(jī)制。

總之,我們?cè)?PTC的研究顯示了 TSHR和RASSF1A兩種基因異常的甲基化在 PTC中是一種較普遍的現(xiàn)象,可能是基因沉寂的一個(gè)潛在分子通路,與 PTC的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系。雖然 DNA甲基化是一個(gè)復(fù)雜的過程,許多細(xì)節(jié)尚未明了,但隨著對(duì)這一領(lǐng)域研究的深入以及對(duì)于腫瘤發(fā)生機(jī)制的逐漸明釋,我們相信它對(duì)于腫瘤早期預(yù)測(cè)與干預(yù)以及預(yù)后評(píng)估等將會(huì)有重要作用。

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