基于重氮功能化直立碳納米管陣列的核酸適配體傳感器的制備及其應(yīng)用于凝血酶的檢測

王 霞，楊麗珠,2，陳 琛，鄭珊珊，李 玲，何品剛*，方禹之

（1.華東師范大學(xué)化學(xué)系，上海200062）

（2.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江溫州325035）

核酸適配體（aptamer）是一類通過SELEX技術(shù)從DNA或RNA庫中篩選出來的新型的單鏈寡核苷酸片段，利用其與目標(biāo)分子的特異性結(jié)合，廣泛應(yīng)用于分子識別領(lǐng)域[1～2]。近年來學(xué)者們都努力尋找與某些疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)能特異性結(jié)合的核酸適配體，以期加強(qiáng)相應(yīng)疾病的診斷和治療。凝血酶（thrombin）作為血液中的一種蛋白酶，在血液凝固、創(chuàng)傷和炎癥等生理和病變過程中都發(fā)揮著重要作用[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，有兩段核酸適配體可以與凝血酶的不同位點(diǎn)進(jìn)行特異性結(jié)合，能形成穩(wěn)定的三明治結(jié)構(gòu)用于傳感器的構(gòu)建。而直立碳納米管作為碳納米管材料的一種，具有定向性好、排列緊密、機(jī)械性能穩(wěn)定、比表面積大以及導(dǎo)電性好等優(yōu)點(diǎn)，在電極修飾檢測研究中，相比常規(guī)電極和一般碳納米管電極具有獨(dú)特的優(yōu)勢[4～6]。

該實驗通過化學(xué)沉積法制備了直立碳納米管陣列，構(gòu)建了一種新型的核酸適配體傳感器用于凝血酶的檢測，實驗原理如圖1所示。利用重氮功能化法對直立碳納米管陣列電極進(jìn)行羧基化修飾，將氨基標(biāo)記的核酸適配體Ⅰ（15堿基序列：5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3'）通過酰胺縮合固定到直立碳納米管陣列電極表面；同時制備了CdS納米顆粒修飾的核酸適配體Ⅱ （29堿基序列：5'-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'），通過三明治結(jié)構(gòu)特異性檢測凝血酶；最后用酸溶解捕獲到直立碳納米管陣列電極表面的CdS納米顆粒，通過溶出伏安法檢測Cd2+的信號。

圖1 實驗原理圖

如圖2所示，凝血酶濃度在1.0×10-8mol/L～1.0×10-12mol/L的范圍內(nèi)，該核酸適配體生物傳感器的檢測信號與凝血酶濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系（r=0.997）。同時，該核酸適配體傳感器通過aptamer-thrombin-aptamer三明治結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，可對凝血酶進(jìn)行特異性檢測，不受其它蛋白質(zhì)如BSA、lysozyme、PHb等的干擾。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性好，為疾病的診斷提供了一定的參考。

圖2 Cd2+氧化峰電流-凝血酶濃度關(guān)系圖

（略）