Dnd1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

李順東 ，于 淼 ，張 勇 ，鄧 來 ，譚宇婷 ，程 潔 ，彭小寧

（1.長沙市第三醫(yī)院，湖南 長沙 410005，2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙410006）

小鼠Dnd1基因第一個睪丸生殖細胞瘤(TGCT)易感基因，研究表明Dnd1基因在進化中具有保守性[1]，因此Dnd1一定具有重要的生物學(xué)功能。近年來，盡管國際同行相繼發(fā)現(xiàn)Dnd1與Apobec3相互作用[2]，Dnd1參與 miRNAs的活性調(diào)控[3]，但該基因在睪丸生殖細胞瘤發(fā)生中的調(diào)控作用及其分子機制仍不清楚。我們實驗室首次發(fā)現(xiàn)過表達Dnd1抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞周期G1期阻滯[4]，為了反向證明這一重要的體外生物學(xué)功能，我們構(gòu)建Dnd1基因RNAi慢病毒載體，以期在哺乳動物細胞中高效、穩(wěn)定表達，從而為深入研究Dnd1細胞分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

慢病毒載體系統(tǒng)購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，包括pGCSIL-GFP載體，pHelper 1.0載體和 pHelper 2.0載體，pGCSIL-GFP載體含有能持續(xù)表達小RNA的元件，同時能表達熒光蛋白，pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體含有病毒包裝所必須的元件。E.coli DH5α感受態(tài)細胞為本實驗室保存；PCR試劑盒購自promega公司，引物由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成，Taq DNA聚合酶為TaKaRa產(chǎn)品;質(zhì)粒重組所用限制性內(nèi)切酶Age I和 EcoR I，連接酶T4 DNA ligase為 NEB公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠購自賽百盛公司；DNA抽提試劑盒購自QIAGEN公司；DMEM低糖培養(yǎng)基干粉購自Gibco公司，標準小牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；包裝細胞293T購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。其他試劑均購自上海生物工程公司和北京鼎國公司。

1.2 方法

1.2.1 Dnd1基因干擾序列的設(shè)計

根據(jù)小鼠Dnd1基因mRNA序列 (BC034897)，按照siRNA設(shè)計原則用Ambion公司的設(shè)計軟件，設(shè)計4條Dnd1的siRNA序列見表1。并用Blast軟件與小鼠基因組比對，保證設(shè)計序列唯一性。Dnd1 Oligo DNA序列按 5'_lingker_sense_loop_antisense_lingker_3'設(shè)計 (5'_lingker為Age I酶切位點，3'_lingker為 EcoR I酶切位點)。病毒載體構(gòu)建框架見表2。上海吉凱基因技術(shù)公司合成Dnd1 Oligo DNA。

表1 小鼠Dnd1特異siRNA序列

表2 小鼠Dnd1sh RNA病毒載體構(gòu)建框架

1.2.2 Dnd1 sh RNA慢病毒載體的構(gòu)建

1.2.2.1 Oligo DNA退火與線性化pGCSIL-GFP載體：退火反應(yīng)體系為 Oligo DNA(sense)(1μg/μL)5 μL，Oligo DNA(antisense)(1μg/μL)5 μL，5×Universal Buffer 20 μL，ddH2O 70 μL。 混勻，9O ℃ 4 min，70℃ 10 min，緩慢冷卻至室溫。12%非變性聚丙烯凝膠電泳(PAGE)凝膠檢測雙鏈 Oligo DNA形成效率。使用Age I和EcoR I進行酶切消化pGCSIL-GFP載體：酶切反應(yīng)體系：純化的DNA質(zhì)粒(1μg/μL)2 μL，10×buffer 5 μL，100×BSA 0.5μL，Age I(10 U/μL)1μL，EcoR I(10 U/μL)1μL，H2O 40.5μL。將上述混合的反應(yīng)物置于37℃，1 h。

1.2.2.2 退火雙鏈Oligo DNA與線性pGCSIL-GFP載體連接：線性化 的pGCSIL-GFP質(zhì)粒黏性末端方便雙鏈核苷酸的定向插入，編碼sh RNA的雙鏈核苷酸連接到pGCSIL-GFP質(zhì)粒上，生成含RNAi盒 (人U6啟動子+雙鏈核苷酸+GF P標記)的pGCSIL-GFP慢病毒載體。

連接反應(yīng)體系:酶切回收的載體DNA(100 ng/μL)1μL，退火的雙鏈 DNA(100 ng/μL)1?L，10×T4噬菌體DNA連接酶緩沖液1μL，T4噬菌體DNA連接酶 1μL，dd H2O 7μL。 于 4℃ 12 h時連接反應(yīng)制備克隆連接液，準備轉(zhuǎn)化。

1.2.2.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌 E.coli DH5a：將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移至含Amp抗性的S0B瓊脂培養(yǎng)基上，37℃ 培養(yǎng)16 h。pGCSIL-GFP載體上所攜帶的抗性基因可使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含Amp抗性SOB瓊脂培養(yǎng)基上生長。

1.2.3 PCR鑒定及DNA測序鑒定

PCR鑒定策略見圖1。陽性克隆上游引物：5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'，下游引物：5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'。 PCR條件：94 ℃，30 s；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72℃，30 s；30個循環(huán)；72℃，6 min。挑選陽性克隆送上海吉凱基因技術(shù)公司測序。

表3 PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 Dnd1 sh RNA慢病毒載體陽性克隆的 PCR鑒定

構(gòu)建好的分別含Dnd1 sh RNA的pGCSILGFP載體的陽性克隆行 PCR鑒定 (圖 2示TARGET2)，結(jié)果提示，靶序列和U6啟動子、GFP連接生成pGCSIL-GFP/U6 RNAi盒；生成正確的入門克隆。連接入vshRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為：343bp(從載體中切掉24bp)；沒有連接入vshRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為：306 bp。挑選陽性克隆送測序。 菌落PCR Template:在連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物長出菌克隆表面沾一下，溶于10μL LB，混勻取1μL作為模板；陰性對照：排除系統(tǒng)中外源核酸污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

2.2Dnd1sh RNA慢病毒載體陽性克隆DNA測序鑒定

選取陽性克隆菌落測序分析，結(jié)果顯示，插入片段序列 TARGET1，TARGET2，TARGET3， TARGET4無核苷酸突變，插入位置正確(圖3示TARGET2)。

3 討論

Dnd1基因在進化中具有保守性，說明一定具有重要的生物學(xué)功能，然而迄今為止，對Dnd1的體外生物學(xué)功能了解甚少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Dnd1過表達抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞周期G1期阻滯和抑制AP-1的轉(zhuǎn)錄活性這些重要的細胞學(xué)功能[4]。因此，反向證明這些生物學(xué)功能十分必要。

RNAi的特異性和強有力的基因表達抑制效果使其成為基因功能研究的得力工具。由于si RNA(Dicer酶切或化學(xué)合成)作用的短暫性，在哺乳動物的RNAi應(yīng)用中受到限制。為克服這一缺陷，多個研究小組設(shè)計了載體介導(dǎo)的RNAi系統(tǒng)，通過RNA多聚酶Ⅲ啟動轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 sh RNA實現(xiàn) RNAi。只要把這種sh RNA表達結(jié)構(gòu)導(dǎo)人細胞，即可實現(xiàn)對特定基因表達的抑制[5]。來源于人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒載體為近年開發(fā)新的病毒載體，慢病毒能感染非分裂期細胞，感染效率高、免疫反應(yīng)性低，最主要是能在體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，與宿主基因組發(fā)生整合而實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達。因此，慢病毒載體作為si RNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢，是抑制基因表達的理想載體。

我們采用吉凱基因提供的Lentivirus為“自殺”性病毒，即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒[6,7]。本研究中慢病毒載體系統(tǒng)由pGCSIL-GFP載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體三質(zhì)粒組成。pHelper 1.0載體中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2.0載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白[8.9]。故該慢病毒載體系統(tǒng)安全、方便、可調(diào)控目的基因表達，為基因功能研究的重要工具之一 。本實驗經(jīng)過PCR篩選陽性克隆及測序鑒定，證明Dnd1 shRNA正確插入pGCSIL-GFP載體，表明成功構(gòu)建了Dnd1基因RNAi慢病毒載體，這為進一步從分子水平研究 Dnd1的細胞學(xué)功能建立了重要基礎(chǔ)。

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