右玉邊雞體質(zhì)量相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選

張李俊 ，張 麗 ，張跟喜 ，周勝花 ，丁馥香 ，劉 旗

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；3.山西省牧草工作站，山西太原 030001）

微衛(wèi)星是20世紀(jì)80年代末期發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記。微衛(wèi)星標(biāo)記具有數(shù)量多、廣泛而隨機(jī)分布于整個(gè)基因組中，多態(tài)性豐富、相對(duì)保守，在進(jìn)化過程中所受選擇壓小、呈孟德爾共顯性遺傳方式、檢測(cè)容易、快速等特點(diǎn)，被認(rèn)為是各類遺傳標(biāo)記中最有價(jià)值的一種[1-3]。

自微衛(wèi)星被發(fā)現(xiàn)以來，就受到家畜遺傳育種學(xué)家們的高度重視，并且充分認(rèn)識(shí)到了把它作為畜種的基因組變異研究具有巨大的潛在價(jià)值。目前，它在構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、評(píng)估遺傳多樣性、繪制系統(tǒng)發(fā)生樹、疾病診斷及親子鑒定等方面顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)，并在人和動(dòng)植物的遺傳研究中得到廣泛應(yīng)用。

高玉時(shí)等[4-5]研究了微衛(wèi)星標(biāo)記與以隱性白羽雞和仙居雞為親本建立的資源群體的屠宰性狀、肉品質(zhì)性狀之間的關(guān)系；孫桂榮等[6]研究了微衛(wèi)星標(biāo)記與絲羽烏骨雞產(chǎn)蛋性狀之間的關(guān)系；徐云翔等[7]研究了微衛(wèi)星標(biāo)記與波爾山羊產(chǎn)羔性狀的關(guān)系；包文斌等[8-9]研究了微衛(wèi)星標(biāo)記與仙居雞12周齡體質(zhì)量及肉雞腹脂率的關(guān)系。

右玉邊雞是我國(guó)著名的地方優(yōu)良品種資源，也是山西省唯一的地方雞種，具有抗嚴(yán)寒、耐粗飼、肉質(zhì)優(yōu)良、蛋大等特點(diǎn)，是適合于我國(guó)北方養(yǎng)殖的優(yōu)良品種[10-12]。早期建立的保種場(chǎng)由于各種原因現(xiàn)已關(guān)閉，只有當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)戶進(jìn)行少量飼養(yǎng)，因此，樣本的采集受到了一定限制，對(duì)邊雞的研究工作非常少。

到目前為止，只檢索到沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院的白文林等[13]運(yùn)用5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)邊雞進(jìn)行的研究。運(yùn)用多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)右玉邊雞的遺傳結(jié)構(gòu)及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)系進(jìn)行研究是非常必要的。鑒于以上原因，我們從右玉縣山區(qū)的農(nóng)戶家中收集種蛋，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進(jìn)行孵化，建立了一個(gè)保種群體。

本試驗(yàn)分析了右玉邊雞的遺傳多樣性，并采用方差分析法分析標(biāo)記基因型與右玉邊雞12，14周齡體質(zhì)量間的連鎖關(guān)系，以期找出連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，為體質(zhì)量的QTL定位和標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

隨機(jī)選取山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所右玉邊雞保種群140只0世代的右玉邊雞（♂∶♀＝1∶1）血樣，翅靜脈采集血樣1.5 mL，肝素鈉抗凝，置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存。采用常規(guī)苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，對(duì)基因組DNA進(jìn)行OD值測(cè)定，并計(jì)算其濃度后備用。獲得每個(gè)個(gè)體已測(cè)定的12，14周齡的體質(zhì)量記錄。

1.2 引物選擇與PCR反應(yīng)

選用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）推薦的29個(gè)雞微衛(wèi)星標(biāo)記中的27個(gè)，另外2個(gè)參照文獻(xiàn)[3]的引物。引物由上海生工生物公司合成。所選擇的29個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的名稱列于表1。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL，包括10 μmol/L引物 2 μL；10×PCR 緩沖液 2.5 μL；2 mmol/L dNTPs 2.5 μL；5 U/μLTaq DNA 聚合酶 0.2 μL；50 ng/μL DNA 模 板 2 μL；25 mmol/L Mg2＋1.5 μL，超純水 14.3 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性6 min；94℃變性 30 s，55～60 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用29∶1的10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法檢測(cè)電泳結(jié)果，UVI凝膠成像系統(tǒng)成像后分析結(jié)果。試驗(yàn)所用Taq DNA聚合酶和dNTPs均購(gòu)自上海生工生物公司，采用pBR322 DNA/BsuRI/Marker作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

通過軟件ONE-Dscan分析基因片段大小，Microsatellite-Toolkit軟件計(jì)算等位基因頻率、多態(tài)信息含量、觀察雜合度與期望雜合度。

根據(jù)試驗(yàn)個(gè)體微衛(wèi)星標(biāo)記基因型和測(cè)定的12，14周齡體質(zhì)量資料，利用SPSS 11.0軟件包中的廣義線性模型（General Linear Model，GLM）對(duì)右玉邊雞12，14周齡的體質(zhì)量與29個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)性進(jìn)行最小二乘方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性

右玉邊雞29個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記共檢測(cè)到143個(gè)等位基因，單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)不等，最少的為2個(gè)（MCW0103，MCW0037），最多的為 11 個(gè)（MCW0104），平均為（4.93±2.20）個(gè)。平均多態(tài)信息含量和平均期望雜合度分別為0.516 8和0.575 0。

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記與體質(zhì)量的方差分析

29個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記與右玉邊雞的12，14周齡體質(zhì)量間的方差分析結(jié)果（表1）表明，共檢測(cè)到10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記（MCW0206，MCW0014，ADL0278，MCW0067，MCW0123，MCW0330，MCW0069，MCW0037，MCW0222 和 ADL0112），同時(shí)對(duì) 12，14周齡體質(zhì)量具有顯著或極顯著的影響（P＜0.05或P＜0.01）；標(biāo)記MCW0034對(duì)12周齡體質(zhì)量具有顯著的影響（P＜0.05）；標(biāo)記LEI0234，MCW0165對(duì)14周齡體質(zhì)量具有顯著的影響（P＜0.05）。

表1 標(biāo)記與右玉邊雞體質(zhì)量間的方差分析結(jié)果（F值）

2.3 9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記不同基因型間的多重比較

根據(jù)方差分析結(jié)果，對(duì)與右玉邊雞的體質(zhì)量關(guān)聯(lián)顯著的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的不同基因型進(jìn)行了多重比較（表2）。由于微衛(wèi)星標(biāo)記MCW0034（19種），LEI0234（29種），ADL0278（15種）和MCW0069（17種）的基因型種類較多，使得很多基因型個(gè)體數(shù)較少，分析的意義不大，所以本研究未列出多重比較的結(jié)果。

此外，微衛(wèi)星標(biāo)記MCW0014中基因型187/201，195/201；MCW0123 中基因型 145/149，145/155，145/159；MCW0330 中基因型 260/294，294/294分別只有1個(gè)個(gè)體，所以在進(jìn)行多重比較時(shí)，對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理。

從表2可以看出，12周齡時(shí)，MCW0206基因型為241/253個(gè)體的體質(zhì)量顯著高于基因型為 237/243，237/237的個(gè)體（P＜0.05）；14周齡時(shí)，MCW0206基因型為241/253個(gè)體的體質(zhì)量顯著高于基因型為237/243，237/237的個(gè)體（P＜0.05）。因此，等位基因 241，253對(duì) 12，14周齡的體質(zhì)量具有顯著的正效應(yīng)。

12周齡時(shí)，MCW0014基因型為199/201，201/201個(gè)體的體質(zhì)量顯著高于基因型為187/187，195/195 的個(gè)體 （P＜0.05）；基因型199/199的個(gè)體體質(zhì)量介于它們之間，沒有達(dá)到顯著水平。14周齡時(shí)，MCW0014基因型為201/201的個(gè)體體質(zhì)量極顯著高于基因型為187/187的個(gè)體（P＜0.01），顯著高于基因型為195/195的個(gè)體（P＜0.05）；199/201的個(gè)體體質(zhì)量顯著高于基因型為187/187的個(gè)體（P＜0.05）?；蛐蜑?01/201的個(gè)體與基因型為199/201的個(gè)體之間差異不顯著。因此，等位基因201對(duì)12，14周齡的體質(zhì)量具有顯著的正效應(yīng)。

12周齡時(shí)，MCW0067基因型為187/187，181/187的個(gè)體體質(zhì)量顯著高于基因型為183/183的個(gè)體（P＜0.05），但 183/183的個(gè)體只有3個(gè)，與其他基因型之間無顯著差異；在14周齡時(shí)，MCW0067基因型為187/187，181/187的個(gè)體體質(zhì)量顯著高于基因型為183/183，181/181的個(gè)體（P＜0.05），等位基因187對(duì)14周齡的體質(zhì)量具有顯著的正效應(yīng)。

12，14周齡時(shí)，MCW0123基因型為149/153的個(gè)體體質(zhì)量顯著高于其他基因型的體質(zhì)量（P＜0.05），但這種基因型的個(gè)體數(shù)很少，只檢測(cè)出2個(gè)；MCW0330基因型為260/270的個(gè)體體質(zhì)量顯著高于基因型為270/270的個(gè)體（P＜0.05）；MCW0037基因型為 157/157，161/161 的2種純合型個(gè)體的體質(zhì)量顯著高于雜合型157/161個(gè)體的體質(zhì)量（P＜0.05）；MCW0222基因型為220/224的個(gè)體體質(zhì)量顯著高于其他基因型的體質(zhì)量（P＜0.05），但這種基因型的個(gè)體數(shù)很少，只檢測(cè)出2個(gè)；ADL0112基因型為124/130的個(gè)體體質(zhì)量顯著高于其他基因型的體質(zhì)量（P＜0.05），但這種基因型的個(gè)體數(shù)很少，只檢測(cè)出2個(gè)。

對(duì)于MCW0165，多重比較顯示，各種基因型之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記不同基因型在體質(zhì)量上的多重比較（鄧肯氏法）

從表2比較結(jié)果可以看出，微衛(wèi)星標(biāo)記MCW0014，CW0067和MCW0037的效果最好。MCW0014基因型為201/201的個(gè)體12周齡體質(zhì)量分別比基因型187/187，195/195高出138.44，125.13 g（P＜0.05），14周齡體質(zhì)量則分別高出241.36 g（P＜0.01） 和 200.07 g（P＜0.05）；MCW0067基因型為187/187的個(gè)體14周齡體質(zhì)量分別比基因型183/183，181/181高出247.05，226.84 g（P＜0.05）。MCW0037 基因型為157/157，61/161的個(gè)體12周齡體質(zhì)量分別比基因型157/161 的個(gè)體高出 129.04，131.71 g（P＜0.05），14周齡體質(zhì)量則分別高出195.54，213.75 g（P＜0.05），157/157型個(gè)體與 161/161型個(gè)體 12，14周齡體質(zhì)量差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

Tatsuda等[14-15]發(fā)現(xiàn)，雞的1號(hào)染色體和3號(hào)染色體上可能存在控制雞體質(zhì)量的QTLs。Gao等[16]利用分布在雞的23條常染色體和Z染色體上的125個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)F2資源群體進(jìn)行全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)1號(hào)染色體MCW0168和GCT0006標(biāo)記間存在與體質(zhì)量相關(guān)的QTL。高玉時(shí)等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在雞 8，3，5，10，13，23 號(hào)染色體上存在與活體質(zhì)量顯著相關(guān)的標(biāo)記。

本試驗(yàn)研究中，有3個(gè)標(biāo)記，即MCW0020，ADL0268，MCW0248位于1號(hào)染色體上，5個(gè)標(biāo)記（MCW0103，MCW0037，MCW0222，MCW0016，LEI0166）位于3號(hào)染色體上，2個(gè)標(biāo)記（MCW0095，ADL0278）位于8號(hào)染色體上，2個(gè)標(biāo)記（ADL0112，MCW0067） 位 于 10號(hào) 染 色 體 ，1個(gè) 標(biāo) 記（MCW0206） 位于 2號(hào)染色體上，1個(gè)標(biāo)記（MCW0014）位于6號(hào)染色體上，1個(gè)標(biāo)記（MCW0123） 位于 14號(hào)染色體上，1個(gè)標(biāo)記（MCW0330） 位于 17號(hào)染色體上，1個(gè)標(biāo)記（MCW0165） 位于 23號(hào)染色體上，1個(gè)標(biāo)記（MCW0069）位于26號(hào)染色體上。方差分析顯示，標(biāo)記 MCW0206，MCW0014，ADL0278，MCW0067，MCW0123，MCW0330，MCW0069，MCW0037，MCW0222，ADL0112，MCW0034，LEI0234 和MCW0165對(duì)12周齡或14周齡體質(zhì)量有顯著的影響，其余標(biāo)記則差異不顯著。

在本研究中，多個(gè)標(biāo)記對(duì)12，14周齡體質(zhì)量具有顯著影響，說明體質(zhì)量性狀受多個(gè)QTL控制，且效應(yīng)大小不一。多重比較結(jié)果表明，微衛(wèi)星標(biāo)記MCW0014，MCW0067和MCW0037的效果最好，而且這3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中，157/157，161/161，201/201，187/187這4種純合型的個(gè)體都占有很大的比例，且不像雜合型個(gè)體在群體中難以固定，所以在育種實(shí)踐中，可以考慮通過選擇這樣的個(gè)體進(jìn)行留種，在進(jìn)行人工受精時(shí)，進(jìn)行同型交配產(chǎn)生純合型的個(gè)體。標(biāo)記MCW0014基因型201/201和標(biāo)記MCW0037基因型157/157，161/161有望作為12，14周齡體質(zhì)量的輔助標(biāo)記，以提高邊雞12，14周齡的體質(zhì)量。標(biāo)記MCW0067基因型187/187有望作為14周齡體質(zhì)量的輔助標(biāo)記。

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