HPLC測定銀翹解毒片中連翹苷的含量

朱旭峰

（山西省陽泉市第三人民醫(yī)院，山西 陽泉 045000）

銀翹解毒片是由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹葉、甘草組成。其為淡棕色至棕褐色的片或薄膜衣片，除去包衣后顯棕色至棕褐色；氣芳香，味苦辛，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效；用于風(fēng)熱感冒，癥見發(fā)熱頭痛、咳嗽口干、咽喉疼痛等。其主藥連翹的主要生物活性成分連翹苷具有較強(qiáng)的抗菌作用，并能抑制cAMP磷酸二酯酶的活性，故可以用作指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定［1］。為更好地控制其質(zhì)量，保證該制劑的臨床療效，本研究建立了銀翹解毒片中有效成分連翹苷含量的高效液相色譜測定法，該法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為銀翹解毒片的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

銀翹解毒片為山西振東開元制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20100904；乙腈為色譜純?nèi)軇?，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心生產(chǎn)；水為實(shí)驗(yàn)超純水；乙醇、甲醇均為天津威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司生產(chǎn)；中性氧化鋁由上海五四化學(xué)試劑廠提供，試劑均為分析純。連翹苷含量測定對照品，由中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110821-200609。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀：SSI Model 500-detector單元液相色譜儀，PC-3000系統(tǒng)檢測儀，TL-9900色譜工作站，柱溫箱，手動進(jìn)樣器。AUW220D電子天平，KQ-300E型超聲處理器（功率250 W，頻率33 kHz），XYD-10-H實(shí)驗(yàn)室專用純水機(jī)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）十八烷基鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水（25∶75）為流動相；檢測波長277 nm；流速1 mL/min；柱溫20℃。理論塔板數(shù)按連翹苷的峰面積計(jì)算不得低于2 500，進(jìn)樣體積10 μL。在此條件下連翹苷色譜峰峰形對稱，供試品色譜圖中連翹苷能與其他成分很好分離。

2.2 對照品溶液的制備［2］

精密稱取連翹苷對照品5 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。使連翹苷制成每1 mL甲醇含50 μg的溶液作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備［2］

取銀翹解毒片20片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約5片量的細(xì)粉置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，浸漬過夜。超聲處理25 min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。搖勻，濾過，棄去初濾液。精密量取續(xù)濾液15 mL，蒸至近干，加中性氧化鋁1.5 g拌勻，加至中性氧化鋁柱上（100目～120目，1 g，內(nèi)徑 1 cm～1.5 cm），用 70%的乙醇120 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.4 樣品含量測定

吸取供試品溶液及對照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀中，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算其含量，結(jié)果見表1。計(jì)算公式為：

表1 樣品含量測定結(jié)果

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液 2 μL、6 μL、10 μL、14 μL、20 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，峰面積分別為1 071 229、3 213 794、5 356 153、7 498 547、10 713 971。按色譜條件測得峰面積積分值，以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=107 139X-475.8，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，表明連翹苷在10 μg/mL～100 μg/mL之間線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，結(jié)果分別為5 241 340，5 497 239，5 371 493，5 296 280，5 374 372。RSD=1.80%，結(jié)果表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按供試品溶液制備方法制備5份，精密吸取供試品溶液10 μL，測定含量。結(jié)果分別為0.557 mg/片、0.558 mg/片、0.549 mg/片、0.561 mg/片、0.556 mg/片，平均含量為0.556 mg/片，RSD為0.80%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試樣品溶液分別在 0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h進(jìn)樣10 μL，測得連翹苷的峰面積分別為8 985 475、8 975 308、8 975 464、8 875 395、8 862 746、8 918 237，RSD為0.60%。表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（2號樣品，批號：071208）相當(dāng)于一片重量的粉末，精密稱定，精密加入連翹苷對照品溶液10 mL，按供試品制備方法制備樣品，測定總量、回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

3 討 論

流動相中乙腈比例微小的變化會明顯影響連翹苷的保留時(shí)間，實(shí)驗(yàn)表明，乙腈-水比例為25∶75時(shí)，保留時(shí)間較適宜且連翹苷峰形對稱、分離完全。

本方法供試品溶液制備方法簡便易行，在該色譜條件下連翹苷峰分離效果良好，回收率符合要求，結(jié)果理想。本品采用中性氧化鋁柱洗脫的方法除去雜質(zhì)，把對設(shè)備的損害盡可能降到最低程度。根據(jù)對流速的考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為1.0 mL/min的時(shí)候，連翹苷分離效果更好，出峰時(shí)間更適中。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：117-118.

［2］國家藥典委員會.中國藥典高效液相色譜圖集［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：592.