托吡酯對海人酸致癇大鼠海馬組織 P-糖蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

王海燕,張英琦,遲瑛嬌,聶 磊,王麗敏

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科,黑龍江 佳木斯 154003)

目前 ,難治性癲癇(intractable epilepsy,IE,RE)發(fā)病機理不十分清楚,其中研究最多的是多藥耐藥基因1(multidrug-resistance 1,mdrl)及其編碼的能量依賴性轉(zhuǎn)運蛋白 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)通過改變藥物運輸對 MDR形成的影響[1]。近年來隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)多藥耐藥的發(fā)生也與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組有關(guān),NF-κB(nuclear factor of kappa B)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組方面起著關(guān)鍵作用[2～4]。但有關(guān) RE腦組織 NF-κ B水平變化及其托吡酯(TPM)對其表達的影響國內(nèi)外報道甚少。

本實驗通過建立大鼠海人酸(Kainic acid,KA)致癇模型,應(yīng)用免疫組化方法測定海馬 P-gp和 N F-κ B的表達及TPM對其表達的影響 ,以探討 P-gp和 NF-κ B是否參與RE的耐藥機制,從而使 N F-κ B有可能成為 RE治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的 Wistar大鼠 84只,體重 200～ 250g雌雄不拘,由佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供。KA購自美國 Sigma公司;P-gp、NF-κ B免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:將84只大鼠隨機分為3組:生理鹽水對照組24只;KA組30只;TPM治療組30只,在應(yīng)用 KA前每天給TPM治療組大鼠灌胃一次,至第14d灌胃后2h注射 KA。每組再分為 6h、24h、3d3個時間組。

1.2.2 動物模型制作及大鼠驚厥分級:將大鼠麻醉后固定于腦立體定向儀上,頭顱正中切口,暴露前囟,將進樣器針尖抵住前囟位置讀出 X,Y,Z的原始值視為原點,依大鼠立體定向圖譜,所確定的目標(biāo)即右側(cè)海馬 CA3區(qū):X-4.5mm,Y+4.5mm,Z硬膜下4mm,調(diào)整 XY坐標(biāo),顯露硬膜,在調(diào)整 Z值至硬膜下4mm。通過微量進樣器半分鐘內(nèi)緩慢注入KA1 μL,留針3～ 5min。癲癇發(fā)作分級參考 Racine[5]的標(biāo)準(zhǔn)進行分級。

1.2.3 標(biāo)本的制作:分別于 KA注藥后 6h、24h、3d時間點,予 4%多聚甲醛溶液灌注取腦 (雙側(cè)海馬),放入4%多聚甲醛溶液中保存待測。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,連續(xù)切片備用。

1.2.4 免疫組化染色:采用免疫組織化學(xué)方法(ABC),防脫處理;常規(guī)脫蠟;滅活內(nèi)源性酶;修復(fù)抗原;滴加正常山羊血清封閉液室溫20min。按步驟先后滴加適當(dāng)稀釋的Ⅰ抗(兔抗鼠 Pgp,N F-ΚB)和生物素Ⅱ抗;DAB顯色,充分水洗;蘇木素復(fù)染;乙醇梯度脫水、透明;中性樹膠封片觀察。P-gp陽性細胞為細胞漿出現(xiàn)棕黃色,N F-κB免疫反應(yīng)陽性細胞為細胞核染成棕黃色或有棕黃色沉積。每張切片在200倍顯微鏡下觀察海馬陽性細胞數(shù),隨機選取6個視野計數(shù)陽性細胞數(shù)求其平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū) P-gp表達結(jié)果

以膠質(zhì)細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為 P-gp陽性表達細胞。KA組 P-gp的表達較對照組明顯增高 (P＜0.01),P-gp的表達在 KA注射6h后升高 (P ＜0.01),24h時達高峰 (P＜0.01),3d時下降但仍然高于6h組 (P＜0.01);TPM組 P-gp的表達與 KA組各時間點比較無顯著差異(P ＞ 0.05)。(見表1)。

表1 各組大鼠不同時間點海馬 P-gp陽性神經(jīng)元細胞計數(shù)比較 ±s)

表1 各組大鼠不同時間點海馬 P-gp陽性神經(jīng)元細胞計數(shù)比較 ±s)

注:與對照組比較,*P＜0.01;與 K A組比較,#P＞ 0.05。

組別 6h 24h 3d對照組 2.10± 0.742.06± 0.612.08± 0.78 KA組 3.66± 0.62* 18.66± 2.84* 11.21± 1.75*T PM組 4.01± 0.36*# 19.06±2.06*# 11.96± 2.62*#F值 25.69117.6268.55 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 各組大鼠海馬區(qū) NF-κB表達結(jié)果

KA組 N F-κ B的表達比對照組明顯增高 (P ＜0.01),N F-κ B的表達在 KA注射 6h后升高,24h時達高峰(P ＜0.01),3d時仍維持較高水平;TPM組 N F-κB的表達與 KA組各時間點比較無顯著差異 (P＞ 0.05)。(見表2)。

表2 不同處理組在不同時間海馬 N F-κ B陽性神經(jīng)元細胞個數(shù)比較 ±s)

表2 不同處理組在不同時間海馬 N F-κ B陽性神經(jīng)元細胞個數(shù)比較 ±s)

注:與對照組比較,*P ＜0.01;與 K A組比較,#P＞ 0.05。

組別 6h 24h 3d對照組 1.87± 0.291.70± 0.111.81±0.30 KA組 4.73± 0.68* 24.28± 2.09* 24.16± 2.56*T PM組 4.50± 0.86*# 23.96± 3.92*# 22.617± 2.58*#F值 57.77200.55278.23 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 N F-κ B與 P-gp蛋白在 KA模型海馬組織中表達的關(guān)系

在 KA模型海馬組織中 N F-κ B與 P-gp的表達呈正相關(guān) (r= 0.86,P ＜ 0.01)。

3 討論

眾所周知,RE對抗癲癇藥物治療不敏感,主要 MDR1有關(guān)。MDR1編碼 P-gp表達,P-gp實際上是 AT P依賴性藥物排出泵,能將藥物從細胞內(nèi)泵出,降低細胞內(nèi)藥物濃度,減輕細胞毒作用,從而產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象,P-gp的過度表達是引起難治性癲癇多藥耐藥的主要原因。Seegers等[6]在大鼠顳葉癲癇的海人酸(KA)模型中檢測 P-gp在海馬以及其他腦區(qū)表達的時間進程。在癲癇狀態(tài)后24h,齒狀回的內(nèi)皮細胞和海馬的 CAl和 CA3區(qū)的實質(zhì)細胞可見 P-gp的表達明顯升高。本實驗結(jié)果顯示:KA模型組 P-gp的表達明顯升高,這與國內(nèi)外研究結(jié)果基本一致。Crespel[7]利用合并海馬硬化的顳葉癲癇患者術(shù)后病理切片進行免疫組化分析發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)細胞和大腦錐體細胞 N F-κ BP65過度表達 ,并推測癲癇形成過程是由 NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程,其過程是一個被癇樣發(fā)作反復(fù)、短暫激活的慢性過程。Matsuoka等[8]利用大鼠海人藻酸點燃模型發(fā)現(xiàn)癇性發(fā)作后4～ 16h內(nèi)海馬神經(jīng)元N F-κB活化明顯增加,并伴膠質(zhì)細胞 NF-κB持續(xù)活化。本實驗結(jié)果顯示:KA模型組海馬 N F-κB表達顯著升高,這與國外大鼠癲癇發(fā)作使海馬神經(jīng)元 NF-κ B活化明顯增加的研究結(jié)果相符合。本實驗同時在海人酸(Kainate)大鼠模型腦組織中檢測 NF-кB和 P-gp蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)了 N F-кB和 P-gp的表達呈正相關(guān)。綜上分析,N F-κ B參與 RE多藥耐藥可能的機制:一方面 N F-κ B是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控著多種基因的表達,而 N F-кB和 P-gp的表達密切正相關(guān)則提示 MDR1有可能是 N F-к B下游基因之一,在 N F-к B的調(diào)節(jié)激活轉(zhuǎn)錄下 ,過度表達 P-gp蛋白而引起RE多藥耐藥。事實上,Bentires-Alj等[9]證實了 MDR1啟動子區(qū)域的第一外顯子包含一個純化的 N F-к B結(jié)合序列 (‘5-CCTT TCGGGG-3’),而 NF-кB也的確能夠激活連接MDR1啟動子的基因轉(zhuǎn)錄。另一方面,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組可導(dǎo)致RE多藥耐藥的形成,因此與神經(jīng)元的可塑性有關(guān)的因子在RE多藥耐藥形成中起著一定的作用。以往研究發(fā)現(xiàn) AEDs中的卡馬西平、苯妥英鈉、苯巴比妥使 P-gp的表達上調(diào);而拉莫三嗪、托吡酯則不上調(diào) P—gp的表達[10]。本實驗結(jié)果顯示各時間點 TPM組與 KA組比較僅有上升的趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義,這與王等人研究的結(jié)果是一致的。推測 KA致癲癇大鼠海馬組織 P-gp的過度表達是癲癇發(fā)作的結(jié)果,與TPM無關(guān),即 T PM不上調(diào) P-gp的表達。本實驗中,TPM組 N F-κ BP65蛋白表達與 KA組相比,無顯著差異,提示TPM抗癲癇的作用過程可能與 NF-κ B無直接相關(guān),或者存在其他復(fù)雜的分子調(diào)控機制參與這些抗癲癇藥的作用過程。關(guān)于 TPM作用機制與 N F-κB的關(guān)系研究目前少有報道,NF-κ B在 KA點燃癲癇模型中海馬組織的表達變化規(guī)律以及與癲癇腦損傷和腦保護的關(guān)系值得進一步深入探討。

[1] Chayasirisobhon S.The mechanisms ofmedically refractory temporal lobe epilepsy[J].Acta Neurol Taiwan,2009,18(3):155-160

[2] Lubin FD,Ren Y,Xu X,et al.Nuclear factor-kappa B regulates seizure threshold and gene transcription following convulsant stimulation[J].Neurochem,2007,103(4):1381-1395

[3] D'Intino G,Vaccari F,Sivilia S,et al.A molecular study of hippocampus in dogs with convulsion during canine distemper virus encephalitis[J].Brain Res,2006,1098(1):186-195

[4] Mattson MP,Meffert M K.Roles for N F-kappa B in nerve cell survival,plasticity,and disease[J].Cell Death Differ,2006,13(5):852-860

[5] Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation[J].Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1972,32(3):281-294

[6] Seegers U,Potsehka H,Loseher W.Transient increase of P.G glyoprotein expression in endothelium and parenchyma of limblic brain regions in the kainit modelof temporal lobe epilepsy[J].Epilepsy Res,2002,51(3):257-268

[7] SavaskanN E,B rauerAU,Kuhbacher M,et al.Selenuum deficiency increase susceptibility to glutamate induced excito toxicity[J].FA SEB,2003,17(1):112-114

[8] Matsuoka Y,Kitamura Y,Okazaki M,et al.Kainic acid-induced activation of nuclear factor-kappa B in rat hippocampus[J].Exp Brain Res,1999,124(2):215-222

[9] Bentires Alj M,Barbu V,Fillet M,et al.NF-к B transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells[J].Oncogene,2003,22(1):90-97

[10] Ying Wang Tilz,Christian Tilz.Influence of lamotrigine and topiramate on MDRl expression in difficult-to-treat temporal lobe epilepsy[J].Epilepsia,2006,47(2):223-239