慢性肺源性心臟病患者外周血中 Th17的初步研究

鮑文華,許 君,閻紅娥,孫云暉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科,黑龍江 佳木斯 154003)

慢性肺源性心臟病(CPHD)是一種多病因、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜化的疾病,呈慢性進(jìn)行性發(fā)展,嚴(yán)重危害人類健康。近年來(lái),細(xì)胞因子在其發(fā)病中的作用逐漸受到重視。一種新的CD4+T細(xì)胞亞群(Th17細(xì)胞亞群)成為研究的熱點(diǎn)[1]。據(jù)報(bào)道 Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病,防御多種病原體感染、介導(dǎo)慢性炎癥等疾病中發(fā)揮重要作用[2,3],但在 CPHD的研究各文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) Th17細(xì)胞在 CPHD患者外周血中的表達(dá),為進(jìn)一步探討 CPHD的發(fā)病機(jī)制及尋求新的治療方法,減少病死率提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇標(biāo)準(zhǔn)

按第三次全國(guó)肺心病會(huì)議制定的慢性肺源性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇患者;排除入院前曾口服或靜脈給予激素治療者,合并糖尿病,肝炎,肺結(jié)核,冠心病,心肌病 ,腫瘤,甲狀腺功能亢進(jìn)者,自身免疫性疾病患者等;對(duì)照組選擇體檢健康者。

1.2 一般資料

選擇佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科2010-11～2011-07住院的 CPHD 患者 34例 ,女 20例 ,男 14例 ,年齡 48～81歲,平均(61.50±10.90)歲。剛?cè)朐夯颊呒毙约又仄跒榧又仄诮M,經(jīng)治療好轉(zhuǎn)即將出院患者為緩解期組。對(duì)照組20例,男 9例 ,女 11例 ,年齡 45～ 72歲 ,平均 (57.35± 8.46)歲 ,為同期體檢健康者。本研究爭(zhēng)得本院倫理委員會(huì)支持,研究對(duì)象知情,同意配合。

1.3 試劑與儀器

主要試劑:異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人 CD4抗體;藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人 IL-17A抗體;Mouse IgG1PE同型對(duì)照抗體;固定ㄍ透膜試劑盒;佛波酯(PM A)、離子霉素、均購(gòu)自美國(guó) BD Biosciences公司,人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。主要儀器:BD FACS Aria TM Cell Sorter購(gòu)自美國(guó) BD公司;低速臺(tái)式大容量離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠;CO2 INCUBATOR購(gòu)自 Gold-SIM(U SA)INTERN ATIOANL GROUP CO.LTD.

1.4 Th17細(xì)胞檢測(cè)

所有受試者晨起空腹采靜脈血2mL,將采集的標(biāo)本置于肝素鈉抗凝管中,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)將血液1:1稀釋。應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBM C)后加 5倍以上 1640培養(yǎng)基 ,將其離心去清加 1mL含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基,100ng/mL離子霉素 ,1μg/mL PM A,1 μL蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑,混勻置入含有5%CO2、37℃的孵育箱中6h。結(jié)束后分為測(cè)定管及對(duì)照管,分別加入10μL抗人 CD4單抗,4℃暗處孵育30min,洗滌2次后對(duì)細(xì)胞固定透膜處理以便進(jìn)行細(xì)胞因子染色。在測(cè)定管加抗人白細(xì)胞介素17A10μL,對(duì)照管加同型對(duì)照抗體,置于4℃避光30min,洗滌去清后加300μL PBS充分混勻,應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

慢性肺源性心臟病患者外周血中 Th17的表達(dá):患者外周血加重期組 Th17/CD4+T細(xì)胞的比例明顯高于緩解期組及對(duì)照組 (P＜0.01),緩解期組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P ＞ 0.05)(表1)。

表1 CPHD加重期組與緩解期組、對(duì)照組Th17/CD4+T細(xì)胞的比較(±s)

表1 CPHD加重期組與緩解期組、對(duì)照組Th17/CD4+T細(xì)胞的比較(±s)

注:與加重期組比較*P＜0.01,與對(duì)照組比較△P＞ 0.05。

組別 n Th17/CD4+T細(xì)胞(%)加重期組 342.36±0.96緩解期組 340.89± 0.40△*對(duì)照組 201.03±0.48*

3 討論

CPHD是一種繼發(fā)性心臟病,該病易反復(fù),并發(fā)癥多 ,治療不理想,許多學(xué)者致力于與炎癥、免疫細(xì)胞功能失調(diào)等研究,例如對(duì)免疫球蛋白含量、自然殺傷細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞活性,T細(xì)胞亞群的百分率及 T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定[4]。 2003年,Aggarwal S.等發(fā)現(xiàn)人類存在 Th17細(xì)胞。大量研究證實(shí)該細(xì)胞主要分泌 IL-17A、IL-17F、IL-6、TNF-α、IL-21和 IL-22。IL-17A是一種致炎細(xì)胞因子[5],是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子,可以刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生 IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)和細(xì)胞黏附分子1(cellular adhesion molecule 1,CAM-1)等,也可以聚集并活化中性粒細(xì)胞,在炎癥及氣道重塑中發(fā)揮重要作用。隨著對(duì) Th17細(xì)胞生物學(xué)特性、分化及調(diào)節(jié)機(jī)制的探討,證實(shí)了 Th17細(xì)胞分泌的 IL-17A在多種自身免疫病及炎性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、銀屑病以及哮喘、慢性阻塞性肺疾病患者的血清或組織中高表達(dá)[6,7]。也有學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)觀察到慢性心力衰竭(CHF)患者外周血中 Th17細(xì)胞比例顯著增高,表明與 CHF發(fā)生發(fā)展及惡化密切相關(guān)[8]。 本研究中我們觀察到 CPHD患者急性加重期外周血 Th17/CD4+T細(xì)胞的比例明顯高于緩解期及對(duì)照組,表明 Th17細(xì)胞的變化與CPHD有一定關(guān)系,可能因?yàn)?Th17細(xì)胞的增加,直接和間接釋放大量效應(yīng)因子,引起機(jī)體免疫應(yīng)答,進(jìn)而放大并促進(jìn)炎癥反應(yīng) ,從而引起肺組織及心肌細(xì)胞損害。推測(cè) Th17細(xì)胞的增加參與 CPHD的發(fā)生發(fā)展,我們可以通過(guò)對(duì) Th17細(xì)胞的檢測(cè)來(lái)了解疾病的轉(zhuǎn)歸,為 CPHD預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。

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