幾種不同方法檢測抗蛔蟲抗體的建立

何光志，田維毅*，高 英，王 平，王文佳，奚 錦，俞 琦，曹 峰，黃 高，蔡 琨，韓 潔，王乾宇，劉安勝，安傳偉，查高武，張 鵬

(1貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽550002;2遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;3天橋鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)站;4烏沙鎮(zhèn)格里小學(xué);5捧乍中學(xué))

蛔蟲病呈世界性分布，已成為公共衛(wèi)生問題之一［1，2］。相對其他蟲種來說，蛔蟲的免疫診斷技術(shù)研究較少，發(fā)展也較緩慢。近年研究發(fā)現(xiàn)，宿主感染蛔蟲后能夠引起免疫反應(yīng)，所以蛔蟲感染的免疫學(xué)診斷成為可能［3～6］。2009年12月 ～2010年10月，本研究用蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原，建立了間接血凝試驗(IHA)、間接ELISA和瓊脂擴(kuò)散試驗(AGP)方法檢測采自農(nóng)村小學(xué)生的血清樣本，并對這方法進(jìn)行敏感性比較，以探討這些方法在診斷蛔蟲感染的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試劑 鼠抗人IgG-HRP，購自上海郎頓生物科技有限公司;TMB底物溶液，購自北京天根生物公司;其他產(chǎn)品購自上海華美公司;戊二醛，購自河南省華龍藥業(yè)有限公司;鞣酸，購自上海華美化工有限責(zé)任公司;胎牛血清，購自杭州四季青公司;健康綿羊全血，采自貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心;瓊脂糖，購于北京華美生物有限公司。

1.2 血清樣本 蛔蟲陽性血清、蛔蟲陰性血清和人的鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲陽性血清各10份，由貴陽中醫(yī)學(xué)院微生物及寄生蟲實驗室保存;小學(xué)生血清樣本，采自貴州5個縣農(nóng)村小學(xué)生，共100份。

1.3 方法

1.3.1 蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原的制備 取新鮮的雌性蛔蟲進(jìn)行解剖，在蛔蟲近陰門1/3處，用小剪刀剖開子宮，用生理鹽水洗滌數(shù)次，收集蟲卵用尼龍絹過濾，獲得純凈的蛔蟲蟲卵，將蟲卵置預(yù)冷的(－70℃)研缽內(nèi)，液氮研磨至粉沫狀，然后加入適量生理鹽水，振蕩混勻，4℃冷浸過夜，然后于 4℃，10 000 r/min離心30min，取上清液即得蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原，用紫外分光光度計測定蛋白質(zhì)的含量，分裝暫存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 間接ELISA方法的建立

1.3.2.1 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數(shù)的確定將蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原用0.05 mol/L碳酸鹽(pH9.6)稀釋成20、10、5、1、0.5、0.1 μg/ml 6 個濃度包被酶聯(lián)板，100 μl/孔，每個濃度包被1列。于37℃溫1 h后，放4℃冰箱過夜，取出用0.05%Tween-20(PBS-T)洗滌3次，5min/次，然后在每孔加入1%牛血清白蛋白(BSA)100 μl封閉液，37℃封閉1 h。然后將陽性血清和陰性血清在酶標(biāo)板上1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 倍比稀釋，分別加入酶標(biāo)板中，100 μl/孔，37℃反應(yīng)1 h后，洗滌3次，5min/次。用1%BSA封閉液作1∶8 000稀釋鼠抗人IgG-HRP(按說明書使用)加入酶聯(lián)板，100 μl/孔，37 ℃ 反應(yīng) 1 h，用0.05%PBS-T 洗滌 3 次，5min/次，加入底物溶液(TMB)100 μl/孔，反應(yīng) 15min，最后加入 100 μl 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定OD值。同時用健康人血清作方陣滴定。選擇陽性血清與陰性血清OD490的比值(P/N)最大所對應(yīng)的抗原、抗體稀釋度作為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2.2 ELISA方法建立 將蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原以最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，100 μl/孔于37℃過夜，洗滌 3 次，每次 3min，晾干;加入 100 μl/孔封閉液，37℃溫育1 h，然后將待檢血清按最佳稀釋倍數(shù)稀釋后加入酶標(biāo)板，100 μl/孔，37℃溫育1 h，洗滌3次，晾干，加入最佳工作濃度的鼠抗人IgGHRP 100 μl/孔，37 ℃ 溫育 1 h，洗滌 3 次，每次 3min，晾干，加入 TMB 底物 100 μl/孔，37 ℃ 反應(yīng) 15min，最后加入100 μl 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD490值。

1.3.2.3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定 鼠抗人IgG-HRP 作 1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000倍比稀釋，通過檢測已知陽性和陰性血清，來確定酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。

1.3.2.4 ELISA陰陽性臨界值的確定 取5份健康人血清進(jìn)行ELISA檢測。同時設(shè)陽性和陰性對照。計算健康人血清OD490的平均值(±s)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，求出陰陽臨界限±s+3SD。

1.3.2.5 特異性試驗 用建立的ELISA方法檢測蛔蟲陽性血清、陰性血清各10份，其他寄生蟲病陽性血清(鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲)陽性血清各10份，鑒定本方法特異性。

1.3.3 IHA 方法的建立

1.3.3.1 綿羊紅細(xì)胞的醛化 經(jīng)靜脈采綿羊全血，5 000 r/min 離心洗滌3 次，10min/次，以 PBS(0.01 mol/L，pH7.4)配成2.5%的細(xì)胞懸液。取9倍體積的細(xì)胞懸液與1倍體積的1%戊二醛溶液混合，在室溫下緩慢攪拌1 h，5 000 r/min離心洗滌3次，10min/次，最后用含有0.1%NaN3的PBS將綿羊紅細(xì)胞稀釋成1%的細(xì)胞懸液。

1.3.3.2 醛化紅細(xì)胞的致敏 將醛化的細(xì)胞懸液用PBS稀釋成10倍體積的細(xì)胞懸液，再與等體積制備的蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原混合，于室溫條件下攪拌2 h，離心洗滌，用含 0.1%NaN3、1%BSA 的PBS洗滌，再用含0.1%NaN3、1%BSA 的 PBS配成1%的細(xì)胞懸液，即為蛔蟲間接血凝診斷試劑。

1.3.3.3 IHA最佳工作條件的確定 取蛔蟲間接血凝診斷試劑與蛔蟲陽性血清進(jìn)行IHA試驗。①采用0.01%、0.02% 和 0.04% 的致敏紅血球濃度進(jìn)行IHA，確定最佳反應(yīng)濃度;②在最佳反應(yīng)濃度的條件下，采用4℃、20℃和37℃進(jìn)行IHA，確定最佳反應(yīng)溫度;③在最佳反應(yīng)濃度和最佳反應(yīng)溫度的條件下采用30min、45min和60min進(jìn)行IHA，確定最佳反應(yīng)時間。以陰性和陽性反應(yīng)界限明顯作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3.4 特異性試驗 采用建立的IHA檢測蛔蟲陽性血清、陰性血清各10份，其他寄生蟲病陽性血清(鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲)陽性血清各10份，鑒定本研究制備的診斷試劑的特異性。

1.3.4 AGP的建立 以1.3.1制備的蛔蟲卵可溶性抗原，采用蛔蟲陽性血清、陰性血清、鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲陽性血清各10份進(jìn)行AGP，驗證重組蛋白作為抗原檢測蛔蟲抗體是否具有特異性。

1.3.5 臨床血清樣本的檢測 采用本實驗建立的間接ELISA、IHA和AGP方法對100份人血清樣本進(jìn)行檢測，這些血清樣本對應(yīng)糞便樣本在采血時現(xiàn)場進(jìn)行糞檢蟲卵法確定陽性率為2.0%。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用間接ELISA的建立

2.1.1 蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原和血清最佳工作濃度確定 用本實驗室保持的蛔蟲陽性血清和陰性血清進(jìn)行方陣滴定，重復(fù)3次，測得的平均OD490值分別見表1和表2。可見當(dāng)蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原濃度為1 μg/ml、抗蛔蟲抗體為1∶160 時，陽性血清 OD490值達(dá) 0.364，而陰性血清 OD490值為 0.025，陽性孔顯色明顯，陰性孔不顯色。因此，確定抗原包被濃度為1 μg/ml和抗體1∶160倍稀釋為ELISA的最佳工作濃度。

表1 陽性血清ELISA方陣滴定結(jié)果的平均OD值

表2 陰性血清ELISA方陣滴定結(jié)果的平均OD值

2.1.2 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定 蛔蟲陽性對照OD490大于1.0，在陰、陽性對照差異最大時，酶標(biāo)二抗的稀釋濃度即為最佳工作濃度，由表3看出1∶8 000的稀釋為酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。

表3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度結(jié)果

2.1.3 臨界值的確定 采5份健康人血清用ELISA法進(jìn)行了檢測，每個樣品重復(fù)1次，結(jié)果分別為 0.129、0.116、0.120、0.150、0.124，陽性對照為0.902，陰性對照為 0.015，以(0.128+3 ×0.028)為臨界值，計算出臨界值0.212。

2.1.4 特異性試驗 用本試驗建立的ELISA方法檢測10份蛔蟲陽性血清全為陽性，蛔蟲陰性血清、鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲陽性血清各10份，結(jié)果全為陰性，說明本方法具有很好的特異性。2.2 IHA檢測蛔蟲抗體的建立

2.2.1 IHA最佳工作條件的確定 取本實驗制備的蛔蟲IHA診斷試劑與已知蛔蟲陽性血清和陰性血清進(jìn)行IHA試驗，經(jīng)過測定，采用0.1%的致敏紅血球、20℃作用45min為IHA的最佳反應(yīng)條件。

2.2.2 特異性試驗 取10份蛔蟲陽性血清，10份蛔蟲陰性血清、鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲陽性血清各10份分別與本實驗制備的IHA診斷試劑進(jìn)行特異性試驗，測定結(jié)果8份蛔蟲陽性血清全為陽性，陽性率為80.0%(8/10)，其余全為陰性。

2.3 AGP的建立及特異性試驗 取10份蛔蟲陽性血清，蛔蟲陰性血清、鞭蟲、鉤蟲和蟯蟲陽性血清各10份分別與蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原進(jìn)行特異性試驗，測定結(jié)果表明5份蛔蟲陽性血清，陽性率為50.0%(5/10)，其余全為陰性。

2.4 幾種方法的敏感性比較 將100份血清樣本，用本實驗建立的間接ELISA方法、IHA和AGP比較這些方法的敏感性，陽性率分別為 10.0%(10/100)、7.0%(7/100)、4.0%(4/100)，其中 AGP為陽性的血清樣本間接ELISA方法和IHA試驗檢測結(jié)果全為陽性。

3 討論

蛔蟲病的準(zhǔn)確診斷是開展蛔蟲生物學(xué)及防治等研究的基礎(chǔ)性工作。相對其他蟲種來說，蛔蟲病免疫診斷技術(shù)研究較少。常常采用糞便的直接涂片法或飽和鹽水漂浮法等簡單的方法結(jié)合臨床癥狀對蛔蟲作出診斷。但由于蛔蟲具有特殊生活史，當(dāng)其通過糞便檢查檢出蟲卵時，宿主往往已經(jīng)被幼蟲在肝臟、肺臟器官內(nèi)移行而造成了損害，而且糞便檢蟲卵法檢出率低，也容易漏檢。值得注意的是，蛔蟲在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)很難和其他寄生蟲蟲卵區(qū)別，所以傳統(tǒng)診斷方法的敏感性和特異性都很差。因此，建立一種敏感而又特異的檢測方法對控制蛔蟲病具有重要意義。

本研究用蛔蟲蟲卵可溶性蛋白作為包被抗原，建立了蛔蟲特異性抗體的間接ELISA檢測方法，對100份血清進(jìn)行臨床檢測，其陽性檢出率為10.0%;將蛔蟲蟲卵可溶性蛋白標(biāo)記在免疫紅血球上建立了IHA檢測蛔蟲抗體，陽性檢出率為7.0%;以重組蛋白作為抗原，建立AGP，其陽性檢出率為4.0%。實驗結(jié)果表明間接ELISA比AGP和IHA敏感性較強(qiáng)，因此AGP和IHA在蛔蟲病的早期在診斷中容易出現(xiàn)漏檢，研究結(jié)果提示間接ELISA在蛔蟲陽性血清病的早期、快速診斷具有一定的應(yīng)用價值，同時也表明了蛔蟲蟲卵可溶性抗原可用于蛔蟲病的診斷和抗體檢測。

ELISA方法是一種應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測定標(biāo)本的方法，是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行酶免疫反應(yīng)，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。由于ELISA具有敏感性高、一次性檢測樣本多、試驗時間短、易操作等特點，因此倍受青睞［7］。

［1］楊黎青.免疫學(xué)基礎(chǔ)與病原生物學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2004:71-75.

［2］翁培蘭，彭衛(wèi)東.人蛔蟲和豬蛔蟲差異的比較研究［J］.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2006，24(2):140-145.

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［5］Stankiewicz M，Jeska EL.Evaluation of pyrantel-tartrate abbreviated Ascaris suum infections for the development of resistance in young pigs against migrating larvae［J］.Int J Parasitol，1990，20(1):77-81.

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［7］鄒艷波，遲秀娟，王芳.鼠疫間接血凝藥盒制備技術(shù)探討［J］.中國地方病防治雜志，2006，21(1):27-29.