miRNA的研究進(jìn)展及其展望

姜雪鷗，鐘金城

（動物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué)，四川成都610041）

小分子DNA（miRNA）是一類存在于動植物體內(nèi)、大小為21～25 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，對生物體轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控起關(guān)鍵作用［1］。1993年，首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)miRNA let-4；7年后，在果蠅中發(fā)現(xiàn)第2個miRNA let-7。在進(jìn)化中的保守性分析使科學(xué)家驚異地發(fā)現(xiàn)miRNA let-7的形成至少需要有Drosha/DGCR8（Pasha）、Dicer等2種RNA酶（RNaseⅢ）的參與。Drosha/DGCR8定位于細(xì)胞核內(nèi)，它能剪切miRNA前體轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNA），從而釋放出具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、大小為70 nt左右的pre-miRNA，后者在轉(zhuǎn)運(yùn)受體Exportin-5（Exp5）的作用下被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，然后被胞質(zhì)中的另一種RNaseⅢ蛋白Dicer剪切，最終被加工成成熟的miRNA［2］。動物的miRNA位于前體mRNA的內(nèi)含子中，這種安排將使mRNA基因和內(nèi)含子中miRNA共同轉(zhuǎn)錄。近年來，發(fā)現(xiàn)和鑒定的miRNAs越來越多，但植物miRNAs僅占很小一部分，且主要集中于擬南芥和水稻等少數(shù)模式植物中，植物miRNA的靶基因大多編碼轉(zhuǎn)錄因子，與植物的生長、發(fā)育密切相關(guān)；而在動物和人中發(fā)現(xiàn)大量miRNA，已證實(shí)在動物的生長、發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中起重要作用。

1 miRNA的生物功能

1.1 真核生物

近幾年來，人們對miRNA的研究方興未艾，進(jìn)展十分迅速。有一些研究報道指出，miRNA在調(diào)節(jié)植物對環(huán)境脅迫如干旱、鹽害和養(yǎng)分的脅迫反應(yīng)等方面起著重要的作用［3］。成熟的miRNA先與一種稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）的復(fù)合物結(jié)合，再特異性地與目標(biāo)mRNA結(jié)合，引起靶mRNA的降解。由于植物miRNA與其靶mRNA具有很高的堿基互補(bǔ)性，因而植物miRNA的作用方式可能更像小分子RNA干涉（small interfering RNA,siRNA），即RNA干涉對靶基因進(jìn)行降解，miRNA所調(diào)節(jié)的靶基因控制著植物的根、葉、花等形態(tài)發(fā)生，細(xì)胞分化，輸導(dǎo)組織形成等植物生長發(fā)育的各個方面，大多數(shù)miRNA通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子影響細(xì)胞分化和器官發(fā)生［4］。

與植物相反，在動物細(xì)胞中大多數(shù)miRNA與其靶mRNA并不完全互補(bǔ)，miRNA則通過與對應(yīng)mRNA的3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄后的翻譯，從而起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。對動物的研究，從線蟲時序發(fā)育中l(wèi)in-4、let-7的功能被揭示以來，miRNA功能研究不斷得益于miRNA基因功能喪失的突變體。bantam基因突變果蠅由于細(xì)胞數(shù)量減少（而不是細(xì)胞體積減?。┒斐杀纫吧偷膫€體小，相反，bantam過量表達(dá)則會導(dǎo)致果蠅翅膀和眼組織過度生長［5］。此后，Brennecke［6］等證實(shí)bantam miRNA通過控制前凋亡基因hid來促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡。mir-14的缺陷加速了由細(xì)胞死亡激活劑Reaper誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并導(dǎo)致了應(yīng)急反應(yīng)和脂肪代謝缺陷［7］，發(fā)現(xiàn)mir-14與細(xì)胞凋亡和脂肪代謝有關(guān)。而迄今為止，已經(jīng)預(yù)測出上千個哺乳動物miRNA的靶基因，它們對參與調(diào)控基因有著很強(qiáng)的嗜性，例如F$′G參與翻譯抑制的蛋白、miRNA的組成成分和編碼的轉(zhuǎn)錄因子的基因等，但也有許多編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶的基因，暗示miRNA在多種生理過程中具有調(diào)控作用。

在人類miRNA的研究中，Calin等［8］發(fā)現(xiàn)約有50%的miRNAs基因位于與腫瘤相關(guān)的染色體區(qū)域內(nèi)，如染色體發(fā)生雜合性缺失的區(qū)域、發(fā)生重排和擴(kuò)增及斷裂點(diǎn)的區(qū)域等，提示miRNA基因的表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)。此外，已有研究表明，miRNA對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和癌癥發(fā)生有重要的調(diào)控作用［9］，其在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)有著顯著差異，有些miRNA會在腫瘤組織中有低表達(dá)，有些則在腫瘤組織中有高表達(dá)［10］，這說明miRNA在腫瘤發(fā)生過程中起了至關(guān)重要的作用。Calin等［11］研究發(fā)現(xiàn)患有一種成年型B細(xì)胞慢性淋巴型白血病（CLL）的病人常有mir-15a、mir-16基因簇的缺失或表達(dá)下調(diào)，65%的CLL病人、50%的外套細(xì)胞淋巴瘤病人、16%～40%的骨髓瘤病人、60%的前列腺癌病人中有13 q14位點(diǎn)的缺失，顯示miRNA可能起到抑癌基因作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)mir-15a和mir-16可通過抑制BCL-2基因的表達(dá)水平而阻止癌癥的發(fā)生。Lu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，較少的miRNAs（約200個）表達(dá)譜就可以對人類癌癥進(jìn)行診斷和分類，與mRNA表達(dá)譜（5%）相比，其準(zhǔn)確度高達(dá)70%。近來發(fā)現(xiàn)的一簇miRNA，mir-17-92多順反子，定位于人B細(xì)胞瘤中DNA擴(kuò)增區(qū)域，對其研究結(jié)果表明，mir-17-92簇可能為潛在的致癌基因。Takamizawa［13］等發(fā)現(xiàn)，肺癌患者中 let-7miRNA 表達(dá)水平降低，且let-7水平降低的患者在手術(shù)切除后存活時間更短；此外，在體外高表達(dá)let-7的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549可抑制肺癌細(xì)胞的生長。Johnson［14］等研究表明，let-7 miRNA在線蟲和人瘤細(xì)胞系中負(fù)調(diào)控RasGTP酶癌基因家族，暗示let-7可能是腫瘤抑制基因。Chan［15］等發(fā)現(xiàn)mir-21在惡性腦瘤和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中顯著高表達(dá)，并且mir-21可能通過阻止關(guān)鍵凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)惡性表型。

1.2 原核生物

miRNA除了在多細(xì)胞生物中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用外，還廣泛存在于單細(xì)胞生物中。單細(xì)胞生物中的miRNA，都可在體內(nèi)和體外對靶標(biāo)mRNA進(jìn)行切割，這與植物中發(fā)現(xiàn)的miRNA一致，但與多細(xì)胞生物中的miRNA具有顯著差異，這提示miRNA通路形成于這兩條進(jìn)化支系分離之前，而且單細(xì)胞生物中的miRNA是獨(dú)立進(jìn)化而來的［16］。近年來的研究表明，一些病毒也編碼大量的miRNAs，它們在病毒的復(fù)制和感染過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［17］。

2 miRNA的預(yù)測與鑒定

自從第一個miRNA發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)出現(xiàn)了多種鑒定、預(yù)測、分析miRNA的方法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，主要有以下幾種方法。

2.1 cDNA文庫法

該方法是首先從細(xì)胞組織中提取總RNA，用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，回收大小為20～25個核苷酸的RNA分子，利用T4連接酶，直接將人工合成的3′和5′接頭連接到RNA上，經(jīng)PCR反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增這些序列，建立miRNAs的cDNA文庫，進(jìn)行克隆、測序，然后用生物信息學(xué)軟件定位其在基因組中的位置，并驗(yàn)證是否具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體和該發(fā)夾結(jié)構(gòu)在其它物種中的保守性，最后將具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小分子RNA進(jìn)行Northern雜交等來檢測其表達(dá)情況，將符合miRNA標(biāo)準(zhǔn)的小分子RNA鑒定為新的 miRNA［18］。

2.2 生物信息學(xué)分析

表1 第一代miRNA靶基因預(yù)測軟件

表2 第二代miRNA靶基因預(yù)測軟件

動植物中的miRNA可以用直接克隆的方法加以鑒定。一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了不同組織、不同發(fā)育時期或不同生長條件下的miRNA基因文庫［21］。但該方法對低豐度miRNAs的鑒定卻相當(dāng)困難，且不可避免大量的重復(fù)測序［22］。由于大部分成熟的miRNAs序列是高度保守的，所以可以通過表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）和基因組序列（GSS）的生物信息學(xué)比對，來搜索或預(yù)測在其他生物中的未知miRNAs，再根據(jù)miRNAs與靶基因mRNAs完全或部分互補(bǔ)的特性預(yù)測其靶基因［23］。實(shí)驗(yàn)證明，生物信息學(xué)方法是預(yù)測和發(fā)現(xiàn)新的miRNA的一個有效方法，它是以基因組序列和計算機(jī)程序鑒定為基礎(chǔ)的方法［24］。目前，通過各種計算機(jī)軟件以及其他計算工具已經(jīng)成功地預(yù)測和鑒定了動植物中的大多數(shù)miRNA［25］。近年來，許多實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出了應(yīng)用于預(yù)測miRNA及其靶基因的計算機(jī)軟件（表 1，表 2）［26］，這些軟件各有優(yōu)缺點(diǎn)，主要依據(jù)miRNA靶位點(diǎn)的保守性、miRNA與其靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性、miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性及附近序列的二級結(jié)構(gòu)等信息編寫其程序。其中TargetScan提出了“種子區(qū)”的概念，增加了預(yù)測的精確度；miRanda是將miRNA-mRNA之間的序列匹配，保守性及熱穩(wěn)定性作為計算參數(shù)，有比較好的檢出率，但是假陽性率也較高；DIANA-microT則主要考慮miRNA調(diào)控單個靶基因的情況，同時考慮中央突起以及miRNA在3′端與mRNA的結(jié)合；RNAhybrid的研究重點(diǎn)在RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方面，能夠更快速準(zhǔn)確地計算miRNA-mRNA雙鏈的自由能，降低了假陽性率；部分學(xué)者的研究結(jié)果顯示，PicTar和TargetScan這兩種軟件的預(yù)測方法、預(yù)測的靶位點(diǎn)在整體上是相似的，而與其他多數(shù)軟件的預(yù)測結(jié)果則相去甚遠(yuǎn)。但RNA22與其他算法不同，不考慮物種間的保守性，檢出率較高。通過比較分析這些miRNA和靶基因預(yù)測軟件，大致可將其分為第一代和第二代兩大類預(yù)測軟件。第一代miRNA及其靶基因預(yù)測軟件主要側(cè)重以下3點(diǎn)：①靶基因非翻譯區(qū)的跨物種保守性；②靶基因與種子序列的互補(bǔ)性；③miRNA靶基因二聚體熱力學(xué)穩(wěn)定性。而第二代預(yù)測軟件是在第一代預(yù)測軟件的基礎(chǔ)上大多從“突破物種間保守”來設(shè)計的，如microTar、miTarget等引入了機(jī)器學(xué)習(xí)方法來提取特征參數(shù)，嘗試從統(tǒng)計學(xué)的角度更好地反應(yīng)miRNA與靶基因相互作用的真實(shí)過程，以彌補(bǔ)保守性這個限制而丟失了的靶基因，取得了一定程度的成功。目前，很難評價哪種方法是最好的。盡管各種方法的基本原理都是相關(guān)的，但由于動物miRNA的靶位點(diǎn)很小，而且miRNA與靶位點(diǎn)是不完全互補(bǔ)，因此計算方法中極小的差別就能產(chǎn)生相差很遠(yuǎn)的預(yù)測結(jié)果。并且對于計算位點(diǎn)保守性的得分標(biāo)準(zhǔn)，3′UTR的鄰位序列的定義和分析以及對3′UTR的長度和其核苷酸組成考慮等，不同方法間都有顯著的差異，這也會造成結(jié)果的差異。

3 miRNA研究中存在的問題及展望

目前已鑒定的miRNA無論是在植物，還是動物中，其數(shù)目都非常的有限。因此，還有許多其他的miRNA有待于發(fā)現(xiàn)并闡明其功能。例如，現(xiàn)已有研究人員對于牛、羊、豬、家犬、大猩猩等哺乳動物的miRNA，在NCBI數(shù)據(jù)庫中注冊了其分子信息，可對這些哺乳動物進(jìn)行深入的研究，這些miRNA在其各個時期都可能起著重要的作用，也可對其他物種進(jìn)行研究，這為遺傳學(xué)提供了新的研究方向與思想；而針對miRNA在一些疑難疾病，特別是腫瘤和癌癥的發(fā)病機(jī)理中，隨著研究的不斷深入，這類小分子在生命活動中具有廣泛的調(diào)節(jié)功能，同時有助于闡明藥物反應(yīng)的個體機(jī)制，也為藥物設(shè)計與針對性治療提供了潛在目標(biāo)。

目前，一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了不同組織、不同發(fā)育時期或不同生長條件下的miRNA基因文庫，發(fā)現(xiàn)了許多miRNA。但在其功能的分析、最終的表型與表達(dá)等方面的研究，還是較少的，一方面是因?yàn)檠芯縨iRNA的成本太高，所需時間較長；另一方面是還沒有真正地找到一種符合多數(shù)miRNA的研究方案。如何建立一種高效、準(zhǔn)確地搜尋miRNA的方法是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。生物體中已知miRNA通常用的是直接克隆、芯片技術(shù)等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法加以鑒定、驗(yàn)證的。其中直接克隆法針對鑒定那些高豐度的miRNAs有顯著的效果，而對于豐度低、具有組織和階段表達(dá)特異性的miRNA，以及由于自身的物理因素（如轉(zhuǎn)錄后修飾等）［19］而很難通過克隆的方法得到的miRNA，都很難用克隆方法進(jìn)行鑒定，而且不可避免大量的重復(fù)測序，所以通過建cDNA文庫的方法尋找miRNA具有明顯的局限性。此外，一些內(nèi)源性的miRNA以及mRNA和其他非編碼RNA的降解產(chǎn)物對克隆也具有一定的干擾作用［20］。而芯片技術(shù)的應(yīng)用是通過雜交，發(fā)現(xiàn)大量的miRNA分子，從而可以對這些被發(fā)現(xiàn)的miRNA分子進(jìn)行下一步的分析，但是這種方法的缺點(diǎn)是無法直接得到miRNA靶基因、基因位置和前體序列等信息［27］，這會影響對miRNA分子研究的后續(xù)工作。大部分成熟miRNAs序列在生物中是高度保守的。近年來，通過生物信息學(xué)方法來進(jìn)行分析和預(yù)測，除了在對比過程中就能了解前體信息外，還能了解到其靶基因信息，而所得到的miRNA候選基因序列，大多都與已知的miRNAs序列高度相似，這說明根據(jù)miRNA的保守性和物種之間基因組的同源性，用生物信息學(xué)理論和方法篩選、尋找新的miRNA候選序列的方法能夠在較短時間里尋找出一定量的新miRNA分子，速度快、通量大，是一條在生物體內(nèi)尋找到更多miRNA分子的新思路和有效途徑。但是生物信息學(xué)方法也有不足之處，雖經(jīng)多年來的發(fā)展，同源序列搜索法已經(jīng)取得了很大成功，然而要搜索與已知miRNAs/per-miRNAs在序列上和結(jié)構(gòu)上同源的miRNAs/per-miRNAs，需有已知的miRNAs/per-miRNAs為參照，對于不與已知miRNAs/per-miRNAs同源的miRNAs/permiRNAs則行不通。

綜上所述，無論是單純的生物實(shí)驗(yàn)方法還是生物信息學(xué)方法，對于miRNA的研究都有優(yōu)缺點(diǎn)，生物信息學(xué)分析得到的結(jié)果還需進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如果能夠充分地把計算機(jī)、生物信息學(xué)等預(yù)測方法和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法相互補(bǔ)充和有機(jī)結(jié)合，不但能夠減少miRNA靶基因?qū)ふ业拿つ啃裕?jié)約實(shí)驗(yàn)成本，而且可以使人們能夠更有針對性地研究感興趣的miRNA，更加準(zhǔn)確方便地闡明其在生命活動中的功能與意義。

目前，已對牛、羊、豬、家犬、人、大猩猩等哺乳動物的miRNA進(jìn)行了較多的研究，在NCBI數(shù)據(jù)庫中注冊了其分子信息。通過對牛和羊已經(jīng)注冊的miRNA序列進(jìn)行分析得到的一些篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①新預(yù)測miRNA的前體能折疊成發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)；②新預(yù)測的miRNA與成熟的miRNA只能存在0～3個堿基差異；③在miRNA中不能存在環(huán)狀結(jié)構(gòu)；④miRNA中的A+U含量在30%～70%之間；⑤miRNA與其互補(bǔ)序列的差異不能多于6個；⑥發(fā)夾結(jié)構(gòu)必須有較小的自由能。符合以上標(biāo)準(zhǔn)的序列可為以后預(yù)測到牛、羊等動物基因組中新的miRNA序列。

但在動植物中目前已鑒定出的miRNA，其數(shù)目非常有限。還有許多miRNA有待于發(fā)現(xiàn)并闡明其功能，這可能是今后遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的一個新方向和熱點(diǎn)。

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