土壤放線菌的選擇性分離及其代謝產(chǎn)物抗菌活性評價*

譚悠久, 彭 祎, 黃永春

(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所,農(nóng)業(yè)部/天津市產(chǎn)地環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)開放實驗室,300191)

以放線菌為來源的抗生素研究一直備受關(guān)注,在放線菌代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的包括抗生素在內(nèi)的大量新活性物質(zhì)中約70%～80%是從鏈霉菌發(fā)現(xiàn)的[1-2]。雖然從鏈霉菌屬發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)從未間斷過,但鏈霉菌屬外的放線菌也是生物活性物質(zhì)的重要產(chǎn)生菌[3-4]。近年來從鏈霉菌屬外的小單孢菌屬[5-6]、諾卡氏菌屬[7-10]、小雙孢菌屬[11]、馬杜拉放線菌屬[12]、指孢囊菌屬[13]、鏈孢囊菌屬[14]、放線多孢菌屬[15]、游動單孢菌屬[16]、擬無枝菌酸菌屬[17]、北里孢屬[18]、Kibdelosporangium[19]等分離到多種生理活性物質(zhì),顯示了代謝產(chǎn)物多樣性的特點(diǎn)。

本文主要研究土壤樣品中放線菌的選擇性分離,以期分離到利用常規(guī)分離方法出菌率低的放線菌菌株,并對選擇性分離得到的放線菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗菌活性評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

采自安徽、重慶、江蘇、吉林、河北、湖北、山東、四川、天津、云南及德國萊比錫等地不同生態(tài)環(huán)境的45份土壤樣品。

1.1.2 指示菌

1.1.3 培養(yǎng)基

放線菌分離培養(yǎng)培養(yǎng)基(改良的HV培養(yǎng)基)：腐質(zhì)酸 0.1%,K2HPO40.1%,NaCl 0.08%,Mg-SO40.05%,CaCO30.001%,復(fù)合維生素(維生素B1、核黃素 、煙酸 、維生素 B6、泛酸鈣 、肌醇、對氨基苯甲酸各0.000 05%,生物素0.000 025%),土壤浸提液10%,瓊脂2%。

放線菌斜面培養(yǎng)基：酵母膏 0.3%,蛋白胨0.5%,麥芽浸膏 0.3%,葡萄糖1%,瓊脂2%。

真菌培養(yǎng)基：土豆汁 20%,加葡萄糖2%,瓊脂2%。

細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏 0.3%,蛋白胨 1%,氯化鈉0.5%,瓊脂2%。

放線菌平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.5%,酵母膏0.4%,K2HPO40.2%,MgSO40.05%,葡萄糖0.25%,蛋白胨 0.2%,玉米漿 1.2%,麥芽浸膏0.25%,復(fù)合維生素0.01%,瓊脂2%。

放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.5%,酵母膏0.4%,K2HPO40.2%,MgSO40.05%,葡萄糖0.25%,蛋白胨 0.2%,玉米漿 1.2%,麥芽浸膏0.25%,復(fù)合維生素0.001%。

1.1.4 抑制劑

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萘啶酮酸 20 μ g/mL,制霉菌素 50 μ g/mL 。

1.1.5 供試植物

日本天鷹椒(購自天津農(nóng)科院)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集、預(yù)處理、菌株分離

從土壤表面采集土層,用速封袋裝好,帶回實驗室,迅速將土壤樣品風(fēng)干,研磨成粉,用前100℃干熱處理60 min。稱取約1 g預(yù)處理土壤樣品,加入無菌試管,加10 mL滅菌水,充分振蕩,10倍系列稀釋,取200 μ L涂布平板,28℃倒置培養(yǎng)15～25 d,用接種針挑取單菌落于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 放線菌代謝產(chǎn)物抗菌活性平板初篩

從斜面挑取放線菌菌落,于培養(yǎng)皿內(nèi)畫線,28℃倒置培養(yǎng)14 d;用直徑5 mm的打孔器打制帶菌落的瓊脂塊,依次將瓊脂塊等距接到混有指示菌的直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿接40個不同的放線菌菌株;25℃培養(yǎng)2～3 d,觀察抑菌情況,測量抑菌圈直徑。

1.2.3 放線菌抗菌活性復(fù)篩

挑選經(jīng)初篩抑菌活性較強(qiáng)的菌株,從斜面刮取成熟孢子,接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝液量50 mL),200 r/min,28℃培養(yǎng)5 d,離心取上清液備抗菌活性檢測;抗菌活性檢測采用管碟法[20]。

1.2.4 對辣椒疫霉的保護(hù)作用

取4葉期辣椒苗(每盆30棵苗),均勻澆灌發(fā)酵液原液,48 h后將辣椒疫霉菌的孢子懸浮液(孢子濃度106個/mL)灌根,每處理4次重復(fù),以清水為對照,7 d后調(diào)查病情和防治效果,試驗重復(fù)2次。數(shù)據(jù)進(jìn)行5%水平上的差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 放線菌的選擇性分離

從45份土壤樣品中共選擇性地分離到570株放線菌菌株,平均每份土壤分離到約12.7個菌株,堆肥中菌株分出率最高,其次為旱地、礦渣,灰燼和海泥分出率較低。分離效果見表1。經(jīng)鑒定,分離到的放線菌菌株分別屬于鏈霉菌屬、小單孢菌屬、諾卡氏菌屬、小雙孢菌屬、馬杜拉放線菌屬、放線多孢菌屬、游動放線菌,但仍以鏈霉菌屬菌株居多。

表1 不同土壤樣品分離效果

2.2 放線菌代謝產(chǎn)物抗菌活性初篩

對570個放線菌菌株進(jìn)行了瓊脂塊初篩評價。結(jié)果顯示,212個菌株代謝產(chǎn)物顯示了抗真菌或抗細(xì)菌活性,占總菌株數(shù)量的37.2%,33個菌株代謝產(chǎn)物兼具抗真菌活性和抗細(xì)菌活性,占菌株數(shù)量的5.8%;77個菌株代謝產(chǎn)物對黑曲霉有抑制作用,占菌株總數(shù)的13.6%;57株菌代謝產(chǎn)物對棉花枯萎菌有抑制作用,占菌株總數(shù)的10.0%;55個菌株代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌有抑制作用,占菌株總數(shù)的9.7%;137個菌株代謝產(chǎn)物對辣椒疫霉有抑制作用,占菌株總數(shù)的24.2%;59個菌株代謝產(chǎn)物對青枯菌有抑制作用,占菌株總數(shù)的10.4%。

2.3 放線菌抗菌活性復(fù)篩

經(jīng)平板瓊脂塊初篩,挑選出12株對部分指示菌具有較強(qiáng)抑制作用或具有廣譜抗菌活性的菌株進(jìn)行復(fù)篩,復(fù)篩結(jié)果見表2。有4個菌株(TJ211、TJ231、TJ234、TJ430)發(fā)酵液對所有指示菌具有抑制作用,但以TJ231、TJ430菌株抑制效果最明顯;1個菌株(TJ561)發(fā)酵液對所有指示真菌具有強(qiáng)烈的抑制效果,但無抑制細(xì)菌作用。

2.4 菌株發(fā)酵液對防治辣椒疫霉病的保護(hù)效果

將通過搖瓶復(fù)篩獲得的3株具有較強(qiáng)抗真菌活性的菌株搖瓶發(fā)酵,進(jìn)行活體防效評價。結(jié)果見表3,菌株 TJ231、T J430、TJ561對防治辣椒疫霉病的保護(hù)效果分別為56.2%、87.2%、61.4%。

表2 放線菌抗菌復(fù)篩結(jié)果1)

表3 發(fā)酵液對防治辣椒疫霉病的保護(hù)效果1)

3 討論

有較多報道認(rèn)為,土壤樣品的來源決定了分離放線菌的數(shù)量與種類。鏈霉菌廣泛分布于各種環(huán)境;小單孢菌也廣泛分布于各種環(huán)境[21],但以稻田、草地、湖底為主;小雙孢菌主要分布在植物體內(nèi),在紅樹林根圍土壤也有分布[22];諾卡氏菌土生、水生,在河流、湖底和海洋沉積物中均有分布[23]。鏈孢囊菌屬、游動單孢菌屬在森林土壤中有分布[24]。因此,為保證樣品來源的豐度,作者從不同地區(qū)的不同生態(tài)環(huán)境采集了土壤樣品。風(fēng)干土壤樣品在100℃干熱處理60 min,可以除去多數(shù)不耐熱鏈霉菌,能有效分離鏈孢囊菌、小雙孢菌、小四孢菌、馬杜拉放線菌、小單孢菌、游動放線菌等稀有放線菌[25],因此為了減少常規(guī)鏈霉菌,提高稀有放線菌的分出率,本試驗采用了100℃干熱處理60 min的分離方法。采用含腐殖酸、維生素的HV培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,可以提高放線雙孢菌、北里孢菌、小雙孢菌、擬諾卡氏菌、游動放線菌、Longispora等很多未知放線菌的分出率[26]。從分離效果比較,雖然仍以分離到鏈霉菌為主,但也分離到包括小單孢菌、諾卡氏菌、小雙孢菌屬、馬杜拉放線菌屬、放線多孢菌屬、游動放線菌等多種稀有放線菌。

通過平板瓊脂塊初篩,表明選擇性分離到的放線菌是產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的重要類群。復(fù)篩結(jié)果顯示,多數(shù)菌株發(fā)酵液對病原菌的抑制效果基本與初篩結(jié)果相吻合。盆栽試驗表明,搖瓶篩選與盆栽試驗存在一定差異。菌株T J231、TJ561雖然在搖瓶篩選中對辣椒疫霉顯示了強(qiáng)烈的抑制效果,但在活體防效并不明顯。菌株TJ430則在搖瓶篩選與盆栽試驗中具有良好的抑制效果和防效,顯示了較好的開發(fā)應(yīng)用前景,其代謝產(chǎn)物分析工作已經(jīng)在實驗室逐步展開。

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