東北地區(qū)四種常見禾本科雜草病原真菌資源調(diào)查及其致病性測定

何 偉, 鄧 暉, 牛永春*, 趙杏利, 高 潔

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長春 130118; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所,北京 100081)

雜草病原真菌是雜草的天敵,迄今為止,已有很 多用病原真菌防治雜草的成功實例。我國于1963年就用膠孢炭疽菌菟絲子?；?Colletotrichum gloeosporioides f.sp.cuscutae)開發(fā)成為用于防治菟絲子的真菌除草劑“魯保一號”[1]。1979年用列當(dāng)鐮刀菌(Fusarium orobanches)開發(fā)成為防治瓜列當(dāng)?shù)恼婢輨癋798”[2]。1981-1982年,真菌除草劑Devine和Collego在美國相繼上市[3]。此后有關(guān)病原真菌除草方面的研究越來越多。

雜草病原真菌的調(diào)查工作將為真菌除草劑的研究開發(fā)提供材料和基礎(chǔ)。近年來,我國學(xué)者在一些地區(qū)開展了雜草病原真菌資源的調(diào)查。東北地區(qū)稗草、狗尾草、馬唐和虎尾草等禾本科雜草在農(nóng)田、草坪和苗木地中廣泛分布且危害嚴(yán)重,但有關(guān)我國東北地區(qū)雜草病原真菌資源調(diào)查的報道很少,僅見潘麗梅等報道了東北地區(qū)14科26屬雜草上的19屬41種病原真菌[4],其中僅報道了8種禾本科雜草上的10種真菌,并未開展進一步的研究。對東北地區(qū)禾草病原真菌資源的調(diào)查,是對我國雜草病原真菌資源的重要補充。作者于2008-2009年對東北地區(qū)上述4種禾本科雜草的真菌病害進行了調(diào)查,在對所有病害樣本進行病菌分離鑒定的基礎(chǔ)上進行了部分菌株的致病性測定。

1 材料和方法

1.1 病害調(diào)查

于2008年9月中下旬和2009年7月中下旬,分別赴黑龍江省的哈爾濱、尚志和牡丹江,吉林省的長春 、公主嶺、吉林、白河、龍井 、松原 、梅河口、四平和通化,遼寧省的大連、遼陽、普蘭店、蓋州、鞍山、海城和沈陽等縣市,對禾本科雜草真菌病害進行調(diào)查。調(diào)查點類型包括農(nóng)田、草坪、樹林、水溝邊、路邊和菜地。

1.2 樣本采集

在調(diào)查禾本科雜草真菌病害過程中,隨時采集發(fā)病的葉片或莖稈作為樣本,并記錄寄主名稱、采集地點、采集地生境、采集人姓名和采集日期,同時對發(fā)病嚴(yán)重的禾本科雜草進行現(xiàn)場拍照記錄。對于采集的樣本,除進一步對發(fā)病部位進行拍照外,注意將樣本用吸水紙及時壓、晾,使之盡快干燥。

1.3 病原真菌的分離

從病害樣本發(fā)病部位的病健交界處切取組織塊2～5 mm2,用4%(有效氯)次氯酸鈉溶液進行表面消毒3～5 min,無菌水漂洗3次,移入PDA培養(yǎng)基平板上,26℃恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落長出后,從組織塊菌落邊緣挑取少量菌絲,再次移入PDA平板上培養(yǎng)。經(jīng)過移植純化,菌落形態(tài)和孢子形態(tài)均一致的菌株分別移入PDA斜面培養(yǎng)、保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原真菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株接種在PDA培養(yǎng)基上,26℃恒溫培養(yǎng)5 d,記錄菌落形態(tài),觀察記錄孢子形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),測量孢子(20個)和孢子梗大小等,進行詳細(xì)描述,查閱專著文獻進行鑒定。對在PDA平板上不易產(chǎn)孢的菌株,挑取小塊菌餅轉(zhuǎn)移至水瓊脂平板,15 d后進行顯微觀察。

1.4.2 rDNA ITS序列比較

在PDA平板上鋪玻璃紙,然后把供試菌株接種到玻璃紙上,待菌落接近長滿平板時從玻璃紙上收獲菌絲體,用CTAB法提取基因組DNA,采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。

以提取的基因組DNA為模板,用引物 ITS4(5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)對 供試菌株rDNA的ITS區(qū)域進行PCR擴增。反應(yīng)液體積 50 μ L,包括：10×PCR 緩沖液[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),500 mmol/L KCl,0.8%Nonidet P-40]5 μ L,25 mmol/L MgCl25 μ L,引物 ITS4(10 μ mol/L)和 ITS5(10 μ mol/L)各 1 μ L,2.5 mmol/L dNTP 2 μ L,5 U/μ L Taq DNA 聚合酶0.4 μ L,基因組 DNA 1 μ L,雙蒸滅菌水 34.6 μ L 。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min后,95℃變性1 min,53℃復(fù)性1 min,72℃延伸2 min,進行35個循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳分離后,于溴化乙錠溶液(0.5 μ g/mL)中染色 15 min,通過 ALPHA 凝膠成像系統(tǒng)顯示記錄電泳結(jié)果。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測后送到上海英駿生物技術(shù)有限公司測序,測序引物為ITS5。將測得的序列采用BLAST程序與GenBank中的序列進行比較。

1.5 致病性測定

選擇一定數(shù)量來自嚴(yán)重發(fā)病植株的菌株和分離頻率較高的屬種的代表性菌株,在室內(nèi)采用人工接種方法進行致病性測定。

1.5.1 植物苗準(zhǔn)備

將稗草、狗尾草、馬唐和虎尾草的種子分別播種于直徑8 cm的花盆中,每盆播15粒種子,每種禾草按每株供試真菌播種3盆。播種后的花盆置于光照培養(yǎng)室內(nèi),12 h光照和 12 h黑暗交替,溫度為25℃,待小苗2～3葉期時進行接種。

1.5.2 孢子懸浮液制備

將供試菌株轉(zhuǎn)接至PDA平板上,每菌株接4皿,置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩周后,用50 mL滅菌水洗下孢子,經(jīng)雙層滅菌紗布過濾,用血球計數(shù)板計數(shù),用滅菌水調(diào)整孢子懸浮液濃度在1×104～5×105孢子/mL之間,同種菌的不同菌株間孢子濃度差異控制在3倍以內(nèi),加入0.1%的吐溫-80,混勻備用。

1.5.3 接種

取制備好的孢子懸浮液每菌株80 mL用小型噴霧器噴灑在雜草幼苗葉片上,每菌株接種每種草3盆,以噴灑含0.1%吐溫-80的滅菌水作對照。接種后置于封閉容器中保濕24 h,然后置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)室控制在 12 h光照、(28±2)℃和12 h黑暗、(24±1)℃交替,相對濕度30%。

1.5.4 病情記載

接種7 d后調(diào)查雜草幼苗發(fā)病情況。病情分級記載標(biāo)準(zhǔn)：NS,無癥狀;LS,有零星病斑;MS,病斑較大,較多;SS,病斑遍布植物葉片,病斑融合,植株死亡[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種禾本科雜草上的真菌種類

從采自東北地區(qū)19個縣市4種禾本科雜草病害樣本共分離到186個真菌菌株,經(jīng)鑒定分屬于彎孢屬(Curvularia)、平臍蠕孢屬(Bipolaris)、凸臍蠕孢屬(Exserohilum)、莖點霉屬(Phoma)、附球霉屬(Epicoccum)、小光殼屬(Leptosphaerulina)、鐮刀菌屬(Fusarium)、黑孢屬(Nigrospora)、炭疽菌屬(Colletotrichum)和鏈格孢屬(Alternaria)等10個屬,其中83株分屬于10個種[6-10]。不同屬真菌的菌株數(shù)量具有明顯差異,其中鏈格孢屬真菌數(shù)量最多,有96株;其次是平臍蠕孢屬,有 33株;彎孢屬和凸臍蠕孢屬分別有23株和20株,其他各屬真菌數(shù)量比較少。已鑒定到種的真菌中新月彎孢(C.lunata)和麥根腐平臍蠕孢(B.sorokiniana)分別有20株和18株;狗尾草平臍蠕孢(B.setariae)和尖角凸臍蠕孢(E.monoceras)分別有15株和14株,其他真菌菌株數(shù)量相對較少。

新月彎孢、麥根腐平臍蠕孢和鏈格孢屬真菌在4種雜草上均能分離到,除了鏈格孢屬真菌在各種草上出現(xiàn)頻率均較高外,稗草上的優(yōu)勢種有新月彎孢、麥根腐平臍蠕孢和尖角凸臍蠕孢,狗尾草上的優(yōu)勢種是狗尾草平臍蠕孢,馬唐上的優(yōu)勢種是新月彎孢。而尖角凸臍蠕孢、梭形凸臍蠕孢和刺盤孢屬真菌僅在稗草上分離到(表1)。

表1 4種禾本科雜草上分離到的真菌種類和菌株數(shù)量

2.2 主要真菌類群的致病性

從鑒定的186株真菌中挑選常見的、分離率較高的4屬7種共31個菌株進行了致病性測定。

2.2.1 彎孢屬(Curvularia)

對6株新月彎孢(C.lunata)和1株間型彎孢(C.intermedia)的致病性測定結(jié)果表明,新月彎孢對4種禾草的致病性均較強且不同菌株對不同禾草的致病性有差異,間型彎孢對4種禾草均無致病性。從虎尾草上分離的3株新月彎孢對稗草和虎尾草致病性均較強,但對馬唐無致病性,對狗尾草致病性具有差異性。從馬唐上分離的2株新月彎孢對馬唐致病性均較強,對其他供試禾草致病性有差異。從狗尾草上分離的1株新月彎孢對狗尾草致病性較強(表2)。

2.2.2 平臍蠕孢屬(Bipolaris)

對9株麥根腐平臍蠕孢(B.sorokiniana)和5株狗尾草平臍蠕孢(B.setariae)進行的致病性測定結(jié)果表明,分離自稗草、狗尾草和虎尾草上的麥根腐平臍蠕孢對稗草和狗尾草均具有致病性。分離自狗尾草的狗尾草平臍蠕孢對狗尾草均具有致病性,部分菌株對稗草和虎尾草也具有致病性,總體上對狗尾草的致病性較強。麥根腐平臍蠕孢和狗尾草平臍蠕孢不同菌株間的致病性均有差異,但兩種菌對馬唐均無致病性(表3)。

表2 彎孢屬(Curvularia)真菌對4種禾草的致病性測定結(jié)果1)

表3 平臍蠕孢屬(Bipolaris)真菌對4種禾草的致病性測定結(jié)果1)

2.2.3 凸臍蠕孢屬(Exserohilum)和鏈格孢屬(Alternaria)

致病性測定的凸臍蠕孢包括2株嘴突凸臍蠕孢E.rostratum、3株梭形凸臍蠕孢E.f usif orme和3株尖角凸臍蠕孢E.monoceras,結(jié)果表明,它們對馬唐均無致病性,對虎尾草無致病性或僅有輕微致病性。除1株分離自馬唐的嘴突凸臍蠕孢對4種草均無致病性外,其他分離自稗草的菌株對稗草或狗尾草均有不同程度的致病性。梭形凸臍蠕孢和尖角凸臍蠕孢對稗草的致病性均比對狗尾草的致病性強,而嘴突凸臍蠕孢對稗草無致病性。2株分離自狗尾草的鏈格孢對狗尾草均具有致病性(表4)。

表4 凸臍蠕孢屬(Exserohilum)和鏈格孢屬(Alternaria)真菌對4種禾草的致病性測定結(jié)果1)

2.3 重要病原真菌的鑒定及形態(tài)特征

2.3.1 新月彎孢[Curvularia lunata(Wakker)Boedijn]

形態(tài)特征(參考菌株HW08194-4)：分生孢子梗長,分生孢子褐色,常具3個離壁隔膜,中間隔膜薄,且顏色深,大多數(shù)孢子從基部起第3細(xì)胞處最大且彎曲,孢身平滑,孢子大小(17.1～ 24.4)μ m×(7.3～12.2)μ m。分子鑒定：經(jīng)對 rDNA ITS序列在NCBI上進行BLAST比對,從發(fā)病稗草、馬唐和虎尾草上分離的新月彎孢菌株與GenBank中Curvularia lunata(登錄號：FJ040177.1)相似性均為100%。

寄主：稗草、馬唐、虎尾草、狗尾草。

稗草上的癥狀：葉片病斑不規(guī)則形,灰白色,邊緣深褐色。馬唐上的癥狀：葉片病斑梭形,中間淺褐色,邊緣深褐色,葉片邊緣和中部均有分布?；⑽膊萆系陌Y狀：葉片病斑圓形,黑色,密布于葉片。狗尾草上的癥狀：初期病斑梭形,褐色,后期病斑中間灰白色,邊緣深褐色。

采集地點：黑龍江哈爾濱和牡丹江;吉林龍井、長春、四平、吉林、公主嶺、通化。

2.3.2 麥根腐平臍蠕孢[Bipolaris sorokiniana(Sacc.)Shoemaker]

形態(tài)特征(參考菌株HW08196-2)：在PDA培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)7 d后,菌落直徑為7.0～8.6 cm,菌落正面灰色、絨毛狀,背面黑褐色,邊緣波浪形或不規(guī)則形。分生孢子梗黃褐色,多數(shù)直,偶爾微彎,單生,未見分支,直徑2.4～6.1 μ m。分生孢子暗褐色,橢圓形或擬紡錘形,直或稍彎,中部寬,兩端略細(xì),頂端鈍圓,表面平滑,有3～12個假隔膜,大小(61.1～78.1)μ m×(19.3～22)μ m。分子鑒定：經(jīng)對 rDNA ITS序列在NCBI上進行BLAST比對,從發(fā)病稗草和狗尾草上分離的麥根腐平臍蠕孢菌株與GenBank中Bipolarissorokiniana(登錄號：EU030351.1)相似性分別為100%和99%。

寄主：稗草、狗尾草。

稗草上的癥狀：發(fā)病初期葉片上散布梭形褐色小斑,后期病斑擴展,梭形、深褐色病斑密布葉片。狗尾草上的癥狀：病斑長梭形,中部灰白色,邊緣深褐色。

采集地點：黑龍江尚志、牡丹江;吉林長春、龍井、四平、吉林、梅河口和白河。

2.3.3 尖角凸臍蠕孢[Exserohilum monoceras(Drechsler)Leonard&Suggs]

形態(tài)特征(參考菌株HW08177-3)：分生孢子梗單生或簇生,直或彎曲,有時上部呈膝曲狀,具隔膜,平滑,深褐色,寬4.9～7.3 μ m。分生孢子淺褐色至深褐色,擬紡錘形,平滑,直或彎曲,4～10個假隔膜,(66～100.2)μ m ×(14.7～19.6)μ m,平均90.5 μ m ×17.5 μ m,臍點明顯突出。分子鑒定 ：經(jīng)對rDNA ITS序列在NCBI上進行BLAST比對,從發(fā)病稗草上分離的尖角凸臍蠕孢菌株與GenBank中的Setosphaeria monoceras(尖角凸臍蠕孢的有性階段,登錄號：DQ337380.1)相似性為98%。

寄主：稗草、狗尾草。

癥狀：發(fā)病初期在葉片兩面或葉鞘上形成褐色小斑點,后擴展成長橢圓形或梭形大斑,病斑邊緣灰白色,有時莖稈上也形成褐色斑。

采集地點：吉林長春、公主嶺、梅河口和四平。

2.3.4 梭形凸臍蠕孢(Exserohilum f usi f orme Alcorn)

形態(tài)特征(參考菌株172-2)：在PDA平板上,菌落灰褐色,中央隆起,氣生菌絲發(fā)達,邊緣整齊,背面褐色。菌絲無色或淡褐色,光滑或略粗糙,具隔膜,多分枝,寬3～6 μ m。分生孢子梗單生或簇生,直或略彎曲,端部常隨產(chǎn)孢呈屈膝狀,淡褐色,光滑,2～8個隔膜,寬4.9～7.3 μ m。分生孢子頂側(cè)生,棕黃色,梭形,多數(shù)中部最寬,兩端漸窄,5～8個假隔膜,(78.2～139.3)μ m ×(17.1 ～ 22)μ m,平 均 112.4 μ m ×18.7 μ m,臍點凸出明顯。分子鑒定：經(jīng)對 rDNA ITS序列在NCBI上進行BLAST比對,從發(fā)病稗草上分離的梭形凸臍蠕孢菌株與GenBank中Exserohilum f usi forme(登錄號：AF163063.1)相似性為98%。

寄主：稗草、狗尾草。

癥狀：發(fā)病初期,葉片分布大量梭形褐色小斑,后期病斑擴展為大的長梭形或橢圓形褐色病斑。

采集地點：黑龍江尚志;吉林長春和松原。

2.3.5 狗尾草平臍蠕孢[Bipolarissetariae(Sawada)Shoemaker]

形態(tài)特征(參考菌株HW08233-2)：在PDA培養(yǎng)基上28℃下培養(yǎng)7 d,菌落直徑6.4～7.0 cm,灰白色,絮狀,菌落背面灰褐色。在PDA培養(yǎng)基上不易產(chǎn)孢,在水瓊脂培養(yǎng)基上易產(chǎn)孢。菌絲黃褐色,有分支,分生孢子梗多單生,直立或稍彎曲,寬3.6～4.9 μ m。分生孢子稍彎曲,很少直立,擬紡錘形或梭形,淡色至褐色,平滑,5～10個假隔膜,(48.9～97.8)μ m ×(12.2～ 14.7)μ m。分子鑒定：經(jīng)對 rDNA ITS序列在NCBI上進行BLAST比對,從發(fā)病狗尾草上分離的狗尾草平臍蠕孢菌株與GenBank中Bipolaris setariae(登錄號：EF452444)的相似性為100%。

寄主：狗尾草、虎尾草、稗草。

癥狀：病斑梭形,深褐色,有的病斑中間灰白色、邊緣深褐色,病斑在葉片中間和邊緣均有分布。

采集地點：黑龍江哈爾濱;吉林長春、龍井、四平;遼寧普蘭店和遼陽。

3 討論

關(guān)于新月彎孢(C.lunata)對稗草和馬唐的致病性研究已有報道[11-12],本研究明確了該菌除對稗草和馬唐外,對狗尾草和虎尾草也可引起病害。耿銳梅等[13]從云南感病稗草上分離到麥根腐平臍蠕孢(B.sorokiniana)并對其生防潛力進行了評價,本研究明確了該菌在狗尾草上也可引發(fā)病害。關(guān)于狗尾草平臍蠕孢(B.setariae),張猛等[14]從河南農(nóng)田感病狗尾草、趙杏利等[5]從北京、河北、河南和青海的發(fā)病狗尾草和其他3種禾草上都分離到該菌。本研究從東北三省的發(fā)病狗尾草和虎尾草分離到該菌多個菌株,表明狗尾草平臍蠕孢是狗尾草及其他一些禾草的重要病菌。趙杏利等的結(jié)果和本研究結(jié)果都表明,狗尾草平臍蠕孢對狗尾草致病性較強,不同菌株其致病性存在差異。用尖角凸臍蠕孢來防除稗草是國內(nèi)外研究的熱點,日本正在商品化生產(chǎn)中[15]。菲律賓研究者[16]也對稗草上分離到的尖角凸臍蠕孢進行了深入研究,目前的難點是孢子生產(chǎn)和適宜劑型。國際水稻所與加拿大 McGill大學(xué)[17-19]合作研究尖角凸臍蠕孢,正與有關(guān)公司合作進行商品化生產(chǎn)。本研究除獲得引起稗草病害的尖角凸臍蠕孢外,還發(fā)現(xiàn)梭形凸臍蠕孢(E.f usiforme)也可引起稗草發(fā)病。

對于新病害、研究較少或不熟悉的病害,分離培養(yǎng)和人工接種對于確定植物病害的病原菌是非常必要的。本研究將野外調(diào)查和分離培養(yǎng)、人工接種相結(jié)合,在初步明確我國東北地區(qū)4種常見禾本科雜草稗草、狗尾草、馬唐和虎尾草上的真菌種類的基礎(chǔ)上,經(jīng)人工接種確定了一些真菌的致病性及在不同禾草上所致病害的癥狀,明確了稗草上的主要病菌有新月彎孢、麥根腐平臍蠕孢、尖角凸臍蠕孢和梭形凸臍蠕孢,狗尾草上的主要病菌有新月彎孢、狗尾草平臍蠕孢和麥根腐平臍蠕孢,馬唐和虎尾草上的病菌主要有新月彎孢。研究結(jié)果豐富了用于控制雜草的病菌資源和信息,為真菌除草劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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