辣椒細菌性瘡痂病病原菌分類、檢測及綜合防治研究進展

陳 新, 劉清波, 趙廷昌*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193;2.湖南農(nóng)業(yè)大學生科院生物技術(shù)系,長沙 410128)

辣椒細菌性瘡痂病在世界各地都有發(fā)生[1],并且是熱帶和亞熱帶地區(qū)辣椒和番茄上的一種主要病害[2]。在國外,研究人員在病害癥狀與發(fā)生規(guī)律、病原菌鑒定、生理小種的分布與變異、病原菌抗藥性與寄主抗性及其遺傳特性、綜合防治等方面進行了很多有益的研究工作[3]。國內(nèi)最早在東北三省有發(fā)生記載,曾列為國內(nèi)檢疫對象,但相關(guān)研究較少[4]。近幾年來,國內(nèi)外一些研究人員在病害癥狀與發(fā)病規(guī)律、病原菌的鑒定與檢測、生理小種的分布與變異和綜合防治等方面取得了一些進展[5-6]。

1 病害癥狀與分布

辣椒細菌性瘡痂病又稱辣椒細菌性斑點病,俗稱“皰病”,是辣椒和番茄上普遍發(fā)生的一種世界性分布的病害。該病害在生產(chǎn)上主要危害辣椒和番茄的葉片、莖蔓和果實。在辣椒上,尤以葉片發(fā)生普遍。葉片發(fā)病,初期形成水漬狀、黃綠色的小斑點,擴大后變成圓形或不規(guī)則形、暗褐色、邊緣隆起、中央凹陷的病斑,粗糙呈瘡痂狀,潮濕時病斑上有菌膿溢出;在番茄上,莖和果實的病斑往往木栓化,病斑開裂,造成瘡痂。

這種病害廣泛分布于濕度較大而天氣暖和的世界各地區(qū)。目前,該病害在歐洲、亞洲、非洲、北美洲、南美洲以及加勒比海地區(qū)的大多數(shù)國家和地區(qū)都有發(fā)生分布[7]。20世紀40年代,土耳其、以色列、希臘、南部非洲、古巴及智利等國家和地區(qū)都把該病害作為檢疫對象。然而后來該病害在這些國家中也迅速蔓延開來。國內(nèi)曾將該病害作為檢疫對象,而在很長一段時間內(nèi)幾乎沒有該病害的相關(guān)研究。1991-1993年,孫福在等[5]調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病害在東北、內(nèi)蒙古的呼和浩特和包頭、山西大同、北京郊區(qū)、新疆的石河子和阜康、山東以及云南等地的辣椒和番茄上不斷發(fā)生和蔓延,造成很大損失。1992年,新疆的李春等[8]對石河子、瑪納斯等地的菌株進行了初步報道。在2007-2009年,趙廷昌等(結(jié)果未公布)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病害在江蘇邳州、安徽合肥、河北保定、內(nèi)蒙古通遼、北京延慶、陜西楊凌、山西朔州、新疆吉木薩爾縣、山東泰安、福建福州以及黑龍江的哈爾濱和雙城等地的辣椒或番茄上都有發(fā)生和分布;龍玲等[9]調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病害是貴州畢節(jié)地區(qū)辣椒上的主要病害之一,并且在辣椒全生育期都產(chǎn)生危害。

2 病原菌

辣椒細菌性瘡痂病病原菌為野油菜黃單胞桿菌辣椒斑點病致病變種[Xanthomonas campestris pv.vesicatoria(Doidge 1920)Dye 1978](下面簡稱 Xcv)。菌體短桿狀,兩端鈍圓,大小為(1.0～1.5)μ m×(0.6～0.7)μ m;單極生鞭毛,能游動;菌體排列成鏈狀,有莢膜、無芽胞;革蘭氏染色陰性,好氣;在YDC平板培養(yǎng)基上,菌落呈圓形,凸起,黃色,黏稠;在CKTM 選擇性培養(yǎng)基上的Xcv菌落比在YDC平板培養(yǎng)基上的要小一些,但是黃色菌落周圍有一圈清晰的菌環(huán)。病菌發(fā)育溫度范圍5～40℃,最適溫度27～30℃,致死溫度為59℃10 min[10-11]。病原菌主要在種子表面或隨病殘體在土壤中越冬,成為病害初侵染來源,病原細菌從氣孔或水孔侵入,在葉片上潛育期為3～6 d,果實上5～6 d。據(jù)報道,在田間,只要最初有10%的植株發(fā)病,就為整塊田發(fā)病提供了足夠的菌量。

2.1 寄主

Dye D W等人[12-14]先后報道了辣椒(Capsicum annuum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、曼陀羅(Daturastramonium)、天 仙 子 (Hyoscyamus spp.)、枸杞(Lycium spp.)、黃花煙草(Nicotiana rustica)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、歐白英(Solanum dulcamara)、龍葵(Solanum nigrum)、小酸漿(Physalisminima)和茄子(Solanum melongena)等都是該病原菌的寄主,其中的辣椒和番茄是其主要寄主。后來,Laub和Stall[15]報道小酸漿和龍葵不是其寄主。因此,對該病原菌寄主的研究工作還需進一步開展。

2.2 分類

1921年,Doidge在南非分離出了引起番茄瘡痂病的病原菌,并將病原菌命名為Bacterium vesicatorium[16]。同年,Gardner和Kendrick在美國印第安納州也分離到了這種病害的病原菌,并將其命名為Bacterium exitiosa[17]。美國的病原菌和南非的病原菌的一個主要區(qū)別在于前者具有很強的水解淀粉活性而后者具有很弱或沒有水解淀粉活性。幾乎在同一時間,Sherbakoff[18]描述了辣椒上的瘡痂病。隨后,Higgins[19]以及 Gardner和 Kendrick[20]先后將Bacterium vesicatorium和Bacterium exitiosa分別同辣椒瘡痂病病原菌進行了多項鑒別試驗并最終確認這3種病原菌是同一種菌,遵照命名優(yōu)先的原則,Gardner和Kendrick建議將這種病原菌命名為Bacterium vesicatorium Doidge。1939年,Dowson將其更名為 Xanthomonas vesicatoria[21]。其后,Dye又更名為Xanthomonascampestris pv.vesicatoria[22]。

早在20世紀60年代,Dye等就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)辣椒瘡痂病病原菌存在相當豐富的表型多樣性[23],但直到20世紀90年代,Vauterin等[24-25]和Stall等[26]才各自獨立研究發(fā)現(xiàn)：在Xanthomonascampestris pv.vesicatoria中存在兩個表現(xiàn)型和遺傳特性不同的組,即A、B組,這兩個組是通過解淀粉、果膠活性測驗和脈沖電場凝膠電泳分析鑒別出來的。1994年,Bouzar等[27]比較了150株從辣椒和番茄上分離到的Xcv菌,研究發(fā)現(xiàn)：A組菌完全沒有水解淀粉、果膠活性,而B組菌具有較強地水解淀粉、果膠活性;A組菌具有一段獨特的32～35 ku大小的蛋白α,而B組菌具有一段25～27 ku大小的蛋白β。Bouzar等[28]利用單克隆免疫反應以及Vauterin等[25]和Stall等[26]利用DNA-DNA雜交試驗都證實了A、B兩個菌組不屬于同一個種。1995年Vauterin等[25]建議將Xanthomonas campestris pv.vesicatoria劃分為2個不同的種,B組菌保留在Xanthomonas vesicatoria中,而將A組菌設為Xanthomonas axonopodis的一個致病變種Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria。

1957年,Sutic[29]在南斯拉夫分離到了番茄上的一種新的病原菌,并將其命名為Pseudomonas gardneri。1966年,Dye[30]將Sutic鑒定的 P.gardneri同其他一些黃單胞菌作了標準測驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)P.gardneri和X.vesicatoria是同一種菌。在20世紀90年代,Bouzar等[31]就已經(jīng)利用Rep-PCR技術(shù)在哥斯達黎加發(fā)現(xiàn)了這種病原菌,而Jones等[32]也研究證實了這2種菌屬于同一個種。另外,Jones等[33]在美國佛羅里達州分離到番茄上的T3小種,經(jīng)血清學和脈沖電場凝膠電泳分析,該菌與上述各菌都不同[32,34]。根據(jù)病原菌對碳基質(zhì)的利用、酶活性、血清學(單克隆抗體反應)、脈沖電場凝膠電泳得到的限制性片段長度多態(tài)性結(jié)果,Jones等[32]將上述兩種病原菌歸為Xanthomonas campestris pv.vesicatoria的兩個不同菌組,即C和D。T3是C組菌的典型菌株。由于C組菌和A組菌的DNA一致性很高,而將C組菌設為Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria。D組菌在遺傳特性上與其他3個菌組沒有共同點,Sutic所鑒定的P.gardneri是D組菌的典型菌株,但P.gardneri的分類地位還很模糊。以Dye[30]的試驗為基礎,經(jīng)過脂肪酸組成分析和病原菌對碳基質(zhì)的利用測驗[28],清楚地發(fā)現(xiàn)Sutic所鑒定的病原菌是一種黃單胞菌。而且,Jones等[32]通過 16S rRNA序列分析證實了這種病原菌與其他3個菌組在系統(tǒng)發(fā)育方面關(guān)系緊密。

最早由Gardner和Kendrick在美國印第安納州鑒定的菌可能就是世界性分布的B組菌,即X.vesicatoria,而Bouzar等[27]所描述的世界性分布的A組菌與Doidge[16]所描述的菌是一樣的,即 X.vesicatoria,為避免異物同名的混亂,Jones等[35]于2004年將 A、B、C、D這 4個表型組命名為4個種：X.euvesicatoria(A 組)、X.vesicatoria(B 組)、X.perf orans(C組)和X.gardneri(D組)。A組包括Doidge描述的所有菌系,B組包括Gardner和Kendrick描述的所有菌系。C組菌是在20世紀90年代從美國佛羅里達州分離得到的。D組菌是1957年Sutic在南斯拉夫分離得到的,后來在哥斯達黎加和巴西也有報道。

A、B、C、D 4個菌組的比較見表1。

表1 4個表型組的分類比較

后來,Jones等[35]檢測了 A、B、C、D 4個菌組的DNA同源性,發(fā)現(xiàn)A組菌和C組菌的DNA一致性高達40%,但A組菌與C組菌、Xanthomonasaxonopodis pv.axonopodis的典型菌株之間的DNA一致性遠低于同種DNA之間的一致性水平(≧70%,根據(jù)Wayne等[36]);另外,B、D兩個菌組之間的DNA一致性不到10%,與A或C菌組之間的DNA一致性也不到10%。

2.3 生理小種劃分和分布

1969年,佛羅里達州的Cook和Stan根據(jù)該病原菌在番茄上感病性及辣椒上過敏性反應的差異,首先提出了小種劃分的依據(jù)(根據(jù)病原菌在辣椒或番茄上的毒性),并依此把佛羅里達的Xcv菌分成3個生理小種[37]。隨后,他鑒定了一些品種的抗病性,并提出了一套初步的鑒別寄主,這套鑒別寄主目前已發(fā)展為辣椒生理小種的5種鑒別寄主,它們分別是‘Early Calwonder'(ECW)、‘ECW-10R'(含有抗性基因Bs1)、‘ECW-20R'(含有抗性基因Bs2)、‘ECW-30R'(含有抗性基因Bs 3)和Capsicum pubescens品種‘PI235047'(含有抗性基因Bs4)[38-39]。目前,國際上共發(fā)現(xiàn)了辣椒上的11個生理小種(P0～P10),詳見表2[35]。

表2 不同生理小種對辣椒不同栽培品種和不同抗病基因的反應

辣椒上的生理小種是根據(jù)它們在ECW及其近等基因品系‘ECW-10R'、‘ECW-20R'和‘ECW-30R'以及 Capsicum pubescens品種‘PI235047'上是否引起過敏性反應來鑒別的。ECW對目前發(fā)現(xiàn)的11個小種都感病;ECW-10R(含有抗性基因Bs1)對小種P0、P2和P5具有抗性;ECW-20R(含有抗性基因 Bs 2)對小種 P0、P1、P2、P3、P7 和 P8具有抗性;ECW-30R(含有抗性基因Bs3)對小種 P0、P1、P4、P7和P9具有抗性;‘PI235047'(含有抗性基因Bs4)對小種 P0、P1、P3、P4 和P6 具有抗性,而小種P10是小種P6的變異株,它對寄主‘PI235047'不具有抗性[39]。小種P1、P2早在1969年在美國就有報道,在1972年巴西也報道了這兩個小種。20世紀80年代,Cook和Stall調(diào)查研究了世界各地辣椒上的生理小種,結(jié)果發(fā)現(xiàn)P1在世界各地都有分布,而P2僅在美國佛羅里達州和瓜德羅普島(法)有分布。P0最早發(fā)現(xiàn)于北卡羅來納州,隨后發(fā)現(xiàn)在墨西哥、巴西、巴巴多斯和美國俄克拉荷馬州都有分布。P3在美國俄亥俄州、佛羅里達州和加勒比海等地都有分布。P4首先發(fā)現(xiàn)于澳大利亞[40],后來在美國東南部、巴巴多斯發(fā)現(xiàn)也有分布。P5、P6在美國有分布,P7、P8在美國俄亥俄州有分布。

在國內(nèi),1992-1993年,孫福在等[41]對采自北京、山西、內(nèi)蒙古、云南和新疆等地的 19個株系,用標準鑒別寄主進行了鑒定。結(jié)果表明：我國存在2個小種,即番茄小種 1(T1)和辣椒、番茄小種 3(PT3)。前者只存在北京地區(qū),后者為我國優(yōu)勢生理小種,遍布我國大部分辣椒、番茄產(chǎn)區(qū)。

分子生物學被用于病原菌分類的同時也被用來鑒別不同小種。Obradovic等[42]根據(jù)hrp基因在4個表型組中的保守序列設計引物,采用REA-PCR方法,先將PCR產(chǎn)物用不同的限制性內(nèi)切酶(CfoⅠ、TaqⅠ和HaeⅢ)進行酶切,再通過凝膠電泳分析差異,從而將瘡痂病病原菌的4個組以及小種區(qū)分開來,同時也與其他細菌性病害病原菌分開,本實驗室的陳新等(結(jié)果未公布)已經(jīng)利用這種方法對采自國內(nèi)新疆、山西、北京、內(nèi)蒙古等地的85個菌株進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述4種表型菌系在85個菌株中都有存在。

2.4 病原菌的檢測

對Xcv菌的檢測鑒定方法大致可分為兩大類：第一大類包括利用半選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)[43-45]、生化測驗[46]、血清學測驗[47-49]、脂肪酸分析和代謝類型分析[50-52];第二大類是以病原菌基因組DNA為基礎的一類方法,按照是否與PCR擴增技術(shù)組合使用可將方法分為兩類[53],即基于PCR的基因組指紋圖譜方法(如：rDNA-PCR、ITS-PCR、tRNAPCR、rep-PCR、AFLP-PCR、AP-PCR 等 等)和DNA-DNA同源性分析。第一大類方法較第二大類方法,檢測所需時間更長,靈敏性和特異性都不及后者。

Kuflu和Cuppels[54]從 Xcv菌株 DC93-1的基因組中獲得了一段功能未知的序列 KK1750(1.8 kb),并利用它制備Southern雜交的探針來檢測病樣中的Xcv菌,如果結(jié)合半選擇性培養(yǎng)基CKTM[45]分離培養(yǎng)病原物,檢測效果會更好,但是完成Southern雜交需要四五天。

Leite等[55-56]利用Xcv菌hrp基因保守序列所設計的引物來擴增待測病原菌的hrp相關(guān)序列,并用幾種特異的限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切,再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行分析,可用于辣椒或番茄的種子帶菌檢測,檢測最低濃度是種子洗液中含菌102～103cfu/mL,其靈敏性大概是常規(guī)ELISA的1 000倍。后來,Obradovic等[42]所用的方法與其類似,只是重新設計了一對引物而已。

Van Doorn等[57]根據(jù)Xcv菌中序列 f imA設計了一對特異性引物,但只能檢測出B組菌(X.vesicatoria)。

Cuppels等[58]對從加拿大安大略省一些番茄種植區(qū)分離到的Xcv菌進行了檢測、鑒定等相關(guān)研究,研究發(fā)現(xiàn)他們所設計的引物對BSX1/2能夠檢測出大多數(shù)的供試菌株,并且靈敏度達到每個反應30～50 cfu。

rhs基因家族存在于大腸桿菌K-12中,具有高度的序列保守性,已被完全測序[59]。Park等[60]研究發(fā)現(xiàn)rhs基因序列在致病變種水平具有差異性,并利用Xcv菌的rhs基因序列設計了致病變種水平的特異性引物,對紅辣椒葉片中的Xcv菌進行檢測,獲得了很好的靈敏度和特異性。

3 抗性鑒定

尋找抗性材料、遺傳研究和抗性育種等都是在抗性鑒定的基礎上完成的。對辣椒細菌性瘡痂病的抗性鑒定是通過滲入法評估過敏性反應的進展、將幼苗浸在帶有表面活性劑的菌懸液中來評估病原菌的寄生和生長情況以及噴霧接種以建立田間病害流行條件而完成的,但最可靠的方法還是在田間進行噴霧接種鑒定[6]。將在YDC瓊脂培養(yǎng)基或King's medium B(KB)培養(yǎng)基上30℃下培養(yǎng)了24～48 h的Xcv菌株懸浮于0.01 mol/L的硫酸鎂(pH7.2)中制成108cfu/mL(A660=0.06)的菌懸液,接種前后均需要保持較高的濕度和溫度。

蒲金基等[61]在對18個海南反季節(jié)辣椒栽培品種的田間發(fā)病調(diào)查中發(fā)現(xiàn),只有海南黃帝椒對細菌性瘡痂病表現(xiàn)免疫,12個品種表現(xiàn)中抗,其余均表現(xiàn)感病或高感。本實驗室的孫福在等[62]利用我國優(yōu)勢小種菌株XV14和XV19[41]的混合懸浮液接種64份辣椒或甜椒品種,最后獲得了5份高抗材料。近期,趙廷昌等(結(jié)果未公布)同樣利用XV14和XV19的混合懸浮液對全國 120份辣椒或甜椒品種進行了抗性鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了12份高抗材料。

4 綜合防治

到目前為止,還未發(fā)現(xiàn)對辣椒或番茄上的所有細菌性瘡痂病菌都具有抗性的商業(yè)品種。因此,選用不帶菌的種子、實行作物輪作、加強田間衛(wèi)生管理、實施精確灌溉、一些殺細菌劑(如：銅制殺菌劑、苯并噻二唑等)和一些殺真菌劑(如：百菌清、代森錳鋅等)組合使用等等是目前防治該病害所廣泛采用的措施。

4.1 化學防治

龍玲等[63]對貴州畢節(jié)地區(qū)大方縣辣椒瘡痂病發(fā)生規(guī)律進行了調(diào)查并對化學防治進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),辣椒瘡痂病在當?shù)匕l(fā)病期一般在5月上旬,危害盛期在6月中旬至7月中旬,7月下旬老病葉大量脫落,新病葉增加緩慢,病情不再發(fā)展,另外,在發(fā)病初期用77%氫氧化銅可濕性粉劑或72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑連續(xù)防治2次,可取得較好防效。

4.2 栽培防治

從無病株或無病果上選留生產(chǎn)用種。種子帶菌可采用55℃溫水浸種10 min或在1∶10的農(nóng)用鏈霉素中浸種30 min或用0.1%的高錳酸鉀溶液浸種15 min,清水清洗后催芽播種。也可冷水浸種10～12 h,再用1%硫酸銅溶液浸種5 min,撈出后用少量草木灰或生石灰中和酸性,即可播種。

Pohronezny等[64]研究發(fā)現(xiàn)秋播比春播能減輕病害發(fā)生、下午播種比上午播種發(fā)病要輕,而在播種操作前用乙醇或聚乙烯吡酮磺洗手也能在一定程度上減輕該病害的發(fā)生。

4.3 生物防治

Kousik等[65]研究了攜帶有不同組合抗性基因的鑒別寄主對生理小種的抗性情況,發(fā)現(xiàn)有些組合能夠大大減輕病害的發(fā)生。

苯并噻二唑是一種植物激活劑,Louw s等[66]研究發(fā)現(xiàn),這種物質(zhì)能誘導番茄在受到Xcv菌侵染時產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。

Abbasi等[67]將木質(zhì)素磺酸銨和磷酸鉀按一定比例配制的混合液噴灑到番茄和辣椒葉片上,發(fā)現(xiàn)這種方法同使用殺菌劑相比,防治效果要好得多,并且能夠提高番茄或辣椒的上市產(chǎn)量。

利用病原菌特異的噬菌體防治該病害是一種很好的方法,但是由于噬菌體在作物葉片上的存活期較短[68],使得防治效果大打折扣。Balogh等[69]研究發(fā)現(xiàn),通過添加一些輔佐劑,能夠提高噬菌體在葉片上的存活期,從而提高了防治效果。

據(jù)報道,許多葉部病原細菌在侵染之前就定殖在葉表面,并且其群落密度與引起的病害嚴重性和發(fā)病率成正相關(guān)。Alexei[70]等設想利用番茄葉片上營養(yǎng)需求與Xcv菌相似的非致病菌來減輕番茄上細菌性瘡痂病的嚴重程度,但結(jié)果發(fā)現(xiàn)：番茄葉片上的營養(yǎng)需求與Xcv菌相似的非致病菌與Xcv菌的營養(yǎng)需求相似程度對于減小番茄葉片上Xcv菌的群落密度無作為,也就不能減輕病害;葉表面的Xcv菌群落密度與引起病害的嚴重程度無關(guān)。

El-Hendawy等[71]用水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)處理番茄葉、根、土壤后取得了對 Xcv菌很好的防治效果,如果在播種前用這種菌處理種子將會得到更好的預防效果。

Moss等[72]利用Xcv75-3菌hrp基因簇中的相關(guān)基因突變體對番茄細菌性瘡痂病的防治效果進行了研究,發(fā)現(xiàn)將突變體75-3ShrpG噴施到番茄葉片上對該病害具有很好的防治效果。

綜合利用生防菌、促進植物生長的根際細菌、系統(tǒng)獲得性抗性誘導因子(如：過敏性抗病性蛋白、苯并噻二唑等)以及Xcv菌的特異性噬菌體等[73-75]防治方法將成為防控該病害的主流趨勢。

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