黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬的生物活性

張瑞明, 趙冬香, 萬(wàn)樹青

(1.農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室,廣州 510642;2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所,儋州 571737)

茶黃薊馬(Scirtothrips dorsa lis Hood),又名茶黃硬薊馬、脊絲薊馬,屬纓翅目,薊馬科,是芒果樹和茶樹的主要害蟲,在我國(guó)海南、廣東、廣西、福建、云南等芒果種植區(qū)均有分布。常見為害對(duì)象還有香蕉、葡萄和花生等作物。在海南,芒果受茶黃薊馬的危害尤為嚴(yán)重[1]。該蟲成、若蟲為害芒果嫩葉、花穗及幼果,早期在葉背取食,隨著蟲口的增加,薊馬轉(zhuǎn)移到葉表面取食。以成蟲、若蟲銼吸芒果樹汁液,造成嫩葉、幼果表面組織銼傷呈木栓化,葉片變色,嚴(yán)重影響芒果嫩葉和幼果的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。近年來(lái),隨著海南省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的改變,熱帶地區(qū)的海南芒果種植面積大幅度增加,茶黃薊馬的為害呈上升趨勢(shì),如不及時(shí)采取有效的防治措施,將導(dǎo)致芒果嚴(yán)重減產(chǎn),甚至失收[1]。目前,對(duì)芒果上茶黃薊馬的防治主要依賴化學(xué)方法,但化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)度頻繁使用無(wú)疑會(huì)加劇薊馬抗藥性產(chǎn)生,殺傷大量天敵,破壞生態(tài)平衡。因此,尋找高效、安全、易降解的新型殺薊馬藥劑顯得尤為緊迫。

黃皮[C lausena lansium(Lour.)Skeels]屬蕓香科黃皮屬(Clausena)植物,別名黃批、黃彈、黃皮子、黃彈子、黃檀子、黃壇子等[3],為原產(chǎn)于我國(guó)熱帶以及亞熱帶地區(qū)的一種特產(chǎn)果樹,在我國(guó)至少已有1 500年的栽培歷史。黃皮具有很高的藥用價(jià)值,其果、葉、根、種子均能入藥,含有香豆素、生物堿等活性成分[4]。目前,有關(guān)黃皮在抑菌、除草和殺蟲方面的報(bào)道很多。劉序銘等[5]報(bào)道,黃皮植株甲醇提取物對(duì)香蕉炭疽病菌和辣椒炭疽病菌等有一定的抑制活性。其中黃皮果核甲醇提取物對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到88.83%。盧海博等[6]報(bào)道,黃皮果核提取物在8mg/ML的處理濃度下,經(jīng)紫外光(波長(zhǎng)365 nm)照射2 h后,對(duì)稗草的根、莖、鮮重的抑制率分別為 87.84%、60.38%、18.40%,非光照處理為 77.99%、45.71%、14.44%;表現(xiàn)出了一定的光活化除草活性。萬(wàn)樹青等[7]報(bào)道黃皮種子甲醇和石油醚提取物對(duì)蘿卜蚜具有很高的殺蟲活性。但對(duì)茶黃薊馬的活性研究還未見報(bào)道。本文以茶黃薊馬為研究對(duì)象,從觸殺和驅(qū)避作用兩方面研究黃皮種子提取物對(duì)茶黃薊馬的生物活性,并對(duì)殺薊馬的活性物質(zhì)進(jìn)行初步分離,為開發(fā)出經(jīng)濟(jì)、安全、有效的植物源殺薊馬劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試蟲

黃皮種子,購(gòu)于廣州市清平中藥材市場(chǎng)。

茶黃薊馬若蟲,采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所溫室大棚內(nèi)芒果的嫩葉上。

對(duì)照藥劑為70%吡蟲啉水分散粒劑,由拜耳作物科學(xué)公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃皮種子粗提取方法

將購(gòu)買的黃皮種子干品,置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中50℃烘干,粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60～80目篩。所得黃皮種子干粉用密封袋密封遮光處保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取一定量的黃皮種子干粉,加入5倍體積的甲醇進(jìn)行浸提,置于避光陰涼處,浸提每次持續(xù)72 h以上,期間數(shù)次搖動(dòng),浸提3次,將提取液合并,抽濾,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干,得黃皮種子甲醇粗提物,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 活性成分的初步分離

采用液-液分配萃取法,稱取10 g黃皮核粗提物,用少量的甲醇溶解后,加入400 ML蒸餾水,轉(zhuǎn)入1 000 ML的分液漏斗中,用石油醚300 ML/次萃取3次。再用乙酸乙酯300 ML/次萃取3次,接著用正丁醇300ML/次萃取3次,最后得到的為水相萃取物,將各部分萃取液濃縮至干,4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生物活性測(cè)定方法

1.2.3.1 驅(qū)避活性測(cè)定

將黃皮種子甲醇提取物樣品用丙酮配制成2.5、5、10、20 g/L 4個(gè)濃度梯度的稀釋液,備用。參考周瓊[8]和張方平[9]的方法：將鮮嫩的芒果葉片帶葉脈剪成直徑為30mm的小圓碟,并保證葉脈兩側(cè)的葉面對(duì)稱一致,然后以葉脈為界,用干凈的毛筆在葉片一側(cè)的正反兩面用試液涂布均勻,另一側(cè)用丙酮處理作為對(duì)照,待葉片晾干,將葉片葉面朝上置于墊有濕棉花的培養(yǎng)皿內(nèi),用大小均勻規(guī)則的濕棉條沿葉片邊緣圍住葉片防止薊馬逃逸。然后將大小一致、健康的薊馬用毛筆輕輕挑在葉片上,每側(cè)15頭,共30頭。用保鮮膜封住培養(yǎng)皿,用昆蟲針在保鮮膜上扎若干個(gè)通氣孔。每個(gè)濃度梯度為一個(gè)處理,每個(gè)處理重復(fù)4次。將培養(yǎng)皿置于溫度為(25±0.5)℃、相對(duì)濕度為75%±3%、光周期為L(zhǎng)∥D=12 h∥12 h的人工氣候箱中,于12 h和24 h檢查處理和對(duì)照葉片兩側(cè)的薊馬數(shù)(葉脈上的薊馬不計(jì)算在內(nèi)),并計(jì)算驅(qū)避率。計(jì)算公式如下：

1.2.3.2 觸殺活性測(cè)定

采用浸葉法[10]：將黃皮種子甲醇提取物用少量的甲醇(低于1%)溶解,滴加少量的吐溫-80乳化,加無(wú)離子水配制成5、10、20、40、60 g/L 共5個(gè)濃度梯度的藥液,并將對(duì)照藥劑吡蟲啉配制成0.017 5、0.035 、0.07、0.14、0.28 g/L 5 個(gè)濃度梯度的藥液。取新鮮完整大小一致的芒果小圓碟葉片(直徑約為30mm)浸入藥液中5 s,取出葉片用吸水紙吸去多余藥液,放入潔凈的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿內(nèi)鋪濾紙,滴清水保濕。每片葉用小毛筆輕輕移入試蟲20頭,每個(gè)處理3次重復(fù),以含有少量吐溫-80的蒸餾水作對(duì)照。最后用保鮮膜封好培養(yǎng)皿,并用針在保鮮膜上扎若干個(gè)通氣孔。將培養(yǎng)皿置于溫度為(25±0.5)℃、相對(duì)濕度為75%±3%、光周期為L(zhǎng) ∥D=12 h∥12 h的人工氣候箱中,于12 h和24 h檢查試蟲的死亡情況(死亡標(biāo)準(zhǔn)：以試蟲不能正?；顒?dòng)或者輕輕觸動(dòng)蟲體無(wú)任何反應(yīng)視為死亡[11]),并計(jì)算死亡率與校正死亡率。計(jì)算公式如下：

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法

死亡率采用Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)法(DMRT法)進(jìn)行方差分析,用Finney幾率分析法求出毒力回歸式,并對(duì)其進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn),求出LC50及其95%置信限。所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003與DPS v7.05軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬的驅(qū)避活性

黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬的驅(qū)避作用結(jié)果見圖1。從圖1可以看出,黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬具有很好的驅(qū)避活性,在2.5 g/L濃度時(shí),對(duì)茶黃薊馬12 h和24 h的驅(qū)避率分別達(dá)到62.07%和63.64%;而在20 g/L濃度時(shí),對(duì)茶黃薊馬12 h和24 h的驅(qū)避率分別高達(dá)92.86%和89.91%。同時(shí),圖1顯示在試驗(yàn)階梯濃度下黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬12 h和24 h的驅(qū)避率,隨著濃度的增加而呈上升趨勢(shì)。另外,在相同處理濃度下,不同處理時(shí)間的驅(qū)避效果有所不同,整體分析,12 h時(shí)的驅(qū)避效果要強(qiáng)于24 h時(shí)。

圖1 黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬的驅(qū)避作用

2.2 黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬的觸殺活性

黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬的觸殺作用結(jié)果見表1。從表1可知,黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬具有一定的觸殺活性,在處理后12 h和24 h對(duì)茶黃薊馬的致死中濃度(LC50)分別為16.60 g/L和12.85 g/L;而對(duì)照藥劑吡蟲啉則顯示出其很好的毒殺效果,在處理后12 h和24 h對(duì)茶黃薊馬的致死中濃度(LC50)分別為0.045 g/L和0.027 g/L。

表1 黃皮種子甲醇提取物處理12 h與24 h后對(duì)茶黃薊馬的觸殺效果

2.3 黃皮種子各萃取相對(duì)茶黃薊馬的觸殺活性

將黃皮種子甲醇粗提物進(jìn)行液-液萃取,分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相萃取物,并將其分別配制成5 g/L的濃度,采用浸葉法測(cè)定上述幾種萃取物對(duì)茶黃薊馬的觸殺活性,結(jié)果見表2。從表2可以看出,黃皮種子甲醇提取物不同溶劑萃取物對(duì)茶黃薊馬的觸殺活性具有明顯的差異。在相同處理濃度下,石油醚萃取物的觸殺活性最強(qiáng),對(duì)茶黃薊馬24 h的校正死亡率為49%。而其他三相萃取物對(duì)茶黃薊馬的觸殺活性則很差。

表2 黃皮種子甲醇提取物的不同溶劑萃取物對(duì)茶黃薊馬24 h的殺蟲活性1)

3 討論

萬(wàn)樹青等[7]在研究幾種植物提取物對(duì)蘿卜蚜的光活化殺蟲活性時(shí),發(fā)現(xiàn)黃皮種子甲醇提取物和石油醚提取物對(duì)蘿卜蚜具有一定的殺滅作用。其中,當(dāng)黃皮種子甲醇提取物濃度在1～5 mg/ML的范圍內(nèi)時(shí),蘿卜蚜的死亡率為60%～90%。馬伏寧等[12]研究發(fā)現(xiàn)黃皮種子甲醇提取物對(duì)松材線蟲(Bursaphelenchus xy lophilus)具有很高的毒殺活性,在1mg/ML濃度下處理72 h的校正死亡率為100%。這些研究表明,黃皮種子中可能含有對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲有效的活性物質(zhì),具有很大的開發(fā)潛力。而且黃皮的整個(gè)果實(shí)(包括果皮、果肉和種子)長(zhǎng)期被作為一種水果和中藥材使用,從黃皮種子中提取的殺蟲化合物對(duì)人類和環(huán)境相對(duì)安全。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：黃皮種子甲醇提取物對(duì)茶黃薊馬具有很好的驅(qū)避作用和一定的觸殺活性,且隨著處理濃度的升高而增強(qiáng)。該結(jié)果再次顯示了黃皮種子代謝產(chǎn)物的殺蟲廣譜性和多種殺蟲作用方式。在不同溶劑的萃取物中,石油醚相萃取物對(duì)茶黃薊馬具有明顯的觸殺活性,而其他三相的觸殺活性則很差,表明黃皮種子中的殺薊馬活性物質(zhì)主要存在于石油醚相,這為進(jìn)一步從黃皮種子中分離殺薊馬活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。總之,要從黃皮種子中開發(fā)出殺薊馬劑,在活性成分的分離純化和殺薊馬活性化合物鑒定以及作用機(jī)理、田間試驗(yàn)等方面還有待深入研究。

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