小麥抗條銹品種遺傳多樣性的SSR分析

劉文濤, 程登發(fā), 康曉慧, 孫京瑞, 張?jiān)苹?羅宵鳳, 張 梅, 張 利, 張 娜

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,綿陽(yáng) 621010)

小麥抗條銹育種親本遺傳基礎(chǔ)的狹窄會(huì)導(dǎo)致育成品種對(duì)條銹菌新小種抵抗能力的下降[1],而目前各國(guó)小麥育成品種所選親本多數(shù)都集中在少數(shù)幾種精英材料上,如此一來(lái)造成了育成小麥品種遺傳基礎(chǔ)的狹窄。所以利用物種內(nèi)、品種間的遺傳多樣性,并選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的抗病種質(zhì)作為雜交的親本,是培育小麥抗條銹新品種的一種有效方法[2]。

小麥的SSR標(biāo)記已有報(bào)道,本研究應(yīng)用大量已報(bào)道的小麥SSR標(biāo)記并從中篩選出條帶清晰且多態(tài)性好的標(biāo)記用于分析我國(guó)幾大小麥產(chǎn)區(qū)主栽品種中抗銹品種的遺傳多樣性,為小麥抗條銹育種親本材料的選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的小麥品種為幾大小麥產(chǎn)區(qū)的主栽品種,共219個(gè),‘銘賢169’作為感病對(duì)照,種子均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。供試菌種為當(dāng)前條銹菌優(yōu)勢(shì)小種和致病類型[3]：Su-4、CYR33和CYR32的混合菌,由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

所用引物的序列來(lái)自 R?dert等[4]和 Gup ta等[5]發(fā)表的小麥微衛(wèi)星引物序列,按照擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好、在染色體上分布均勻的原則篩選到27對(duì)SSR引物,用于小麥抗銹品種的聚類分析。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2 方法

1.2.1 條銹病抗性鑒定

將參試小麥品種播種于四川綿陽(yáng)河西村的中國(guó)農(nóng)科院植保所試驗(yàn)基點(diǎn),成株期進(jìn)行接菌處理[6],待感病對(duì)照充分發(fā)病(反應(yīng)型4級(jí)、嚴(yán)重度90%、普遍率達(dá)95%)時(shí),一次性記錄完畢所有參試品種的反應(yīng)型 ,反應(yīng)型為0、0;、1、2 的為抗病品種,分別對(duì)應(yīng)為免疫、近免疫、高抗、中抗;反應(yīng)型為 3～4的為感病品種,分別對(duì)應(yīng)為中感和高感[7]。對(duì)表現(xiàn)抗病的品種進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2.2 基因組DNA的提取

用Saghai-Maroof等[8]的CTAB法提取小麥幼苗葉片的DNA。提取之后分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)提取 DNA的完整性和濃度、純度,并將 DNA樣品濃度稀釋到 50 ng/μL,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SSR-PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系的體積為20μL,包括：2×PCR mix 10 μL,引物 1 μmol/L 2 μL(左、右引物各1μL),模板 DNA 50 ng/μL 2μL,ddH2O 6 μL;2×PCR mix主要成分包括：Taq DNA聚和酶(recombinant)：0.05 units/μL;MgCl2：4 mMol/L;dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)：0.4 mmol/L;染料。

PCR擴(kuò)增程序：首先94℃預(yù)變性5 min;然后94℃變性1 min,退火(依據(jù)不同引物退火溫度不同)1 min,于72 ℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán);最后在72℃延伸5Min。6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯色。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR擴(kuò)增結(jié)束后,向反應(yīng)管中加入5μL的上樣緩沖液,94℃下變性5min后馬上放到碎冰中降溫備用。6%變性聚丙烯酰胺凝膠上點(diǎn)樣,恒功率60W下電泳1.5～2 h,銀染檢測(cè)擴(kuò)增的情況。

1.2.5 抗銹品種的聚類分析

根據(jù)樣品在SSR位點(diǎn)上不同等位變異在凝膠上的條帶有無(wú),建立0-1矩陣(有帶為1,無(wú)帶為0),應(yīng)用NTSYSpc 2.10軟件計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù),按UPGMA進(jìn)行遺傳相似性聚類分析。各引物的PIC按下述公式計(jì)算：PIC=1-∑P2ij,其中 Pij為第i個(gè)SSR位點(diǎn)第j個(gè)等位變異在全部抗銹材料中出現(xiàn)的頻率。利用NTSYSpc 2.10軟件計(jì)算品種間遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD=1-GS),用UPGMA進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 條銹病抗性鑒定

成株期進(jìn)行接菌處理后,待感病對(duì)照充分發(fā)病時(shí),調(diào)查219個(gè)參試品種的反應(yīng)型所得的結(jié)果是,抗病品種有39個(gè),見(jiàn)表1,其余均表現(xiàn)為中感或高感。

表1 篩選出的小麥抗銹品種

2.2 引物的多態(tài)性信息指數(shù)分析

采用27對(duì)SSR引物對(duì)40份(包括對(duì)照‘銘賢169’)小麥品種進(jìn)行擴(kuò)增,共擴(kuò)增到104個(gè)等位變異,平均每個(gè)SSR位點(diǎn)為3.85個(gè)。引物的PIC在0.210～0.712之間,平均為0.455,通過(guò)PIC可以了解到每個(gè)SSR位點(diǎn)附近小麥基因組的變異程度,PIC指數(shù)越大則變異程度越高,見(jiàn)表2。

表2 27對(duì)SSR引物的多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)

2.3 抗銹品種的遺傳相似系數(shù)分析

在39份抗銹品種中,‘綿麥42’與‘蘭天20號(hào)’之間的遺傳相似系數(shù)最低,為0.250;‘陜麥 139’與‘小偃 216’之間的遺傳相似系數(shù)最高,為 0.896,所有品種之間的遺傳相似系數(shù)平均為0.723。參試材料中抗銹品種的遺傳相似系數(shù)主要分布在0.67～0.76區(qū)段之間。

2.4 抗銹材料的聚類分析結(jié)果

通過(guò)分析抗銹材料的聚類圖(圖1)可以得到,40份材料(包括對(duì)照)在DICE距離1.345處可分為4個(gè)類群。第I類群包括24份材料,占全部材料的60%,第I類群在1.233處又可分為4個(gè)亞群。I-1有16個(gè)品種,在1.175處I-1亞群又可以分為2個(gè)小群。I-1-1有7個(gè)品種,此7個(gè)品種中有4個(gè)品種是春性小麥,同時(shí)也都是早熟至中早熟品種,它們分別是：‘綿麥37’、‘綿麥39’、‘綿麥 185’和‘西科麥 4 號(hào)’,其中‘綿麥39’、‘綿麥185’和‘西科麥 4號(hào)’都含有‘綿陽(yáng)96’的譜系;另3個(gè)品種有2個(gè)是‘西農(nóng)88’和‘西農(nóng)889’,這兩個(gè)品種都是由西北農(nóng)林科技大學(xué)培育成功的,它們都屬于半冬性品種;I-1-1中還有一品種為‘蘭天15號(hào)’,它屬于冬性、中熟品種。I-1-2中有9個(gè)品種,這個(gè)類群比較雜,但也以半冬性品種為多,其中半冬性品種‘周麥22’和‘洛麥21’都是以‘周麥13’作為父本培育成的。I-2有2個(gè)品種：‘新麥19’和感病對(duì)照‘銘賢169’。I-3有5個(gè)品種,此5個(gè)品種均是半冬性、中熟品種,其中‘西農(nóng)3517’和‘西農(nóng)2595’的系譜當(dāng)中均含有‘西農(nóng) 1376’的譜系。I-4只有 1個(gè)品種：‘蘭天17’。第Ⅱ類群包括5個(gè)品種,這5個(gè)品種有2個(gè)是半春性品種,有3個(gè)是半冬性品種,其中半冬性品種‘陜麥139’和‘小偃216’都含有‘小偃22’的系譜。第Ⅲ類群僅有1個(gè)品種：‘綿麥 1403’,屬半春性、早中熟品種。第Ⅳ類群包括10份材料,在1.273處可分為2個(gè)亞群,Ⅳ-1包括 7份材料,除 1份材料屬半春性(XK 0106-108D6)外,其余6個(gè)品種均屬冬性或半冬性。Ⅳ-2包括3個(gè)品種,均是冬性、早中熟至中熟的小麥品種。

3 小結(jié)與討論

篩選出的39份小麥抗銹材料集中在綿麥系、蘭天麥系和陜麥系3個(gè)麥系,而其他的供試材料絕大多數(shù)表現(xiàn)感銹,此39份小麥抗銹材料之間遺傳關(guān)系較近,27對(duì)SSR引物僅擴(kuò)出104個(gè)等位變異,平均每對(duì)引物為3.85個(gè)?？逛P品種的聚類結(jié)果顯示,并不是所有育種單位相同和血緣相近的品種都聚到了一起,也并不是所有生育期相似的品種都聚到了一起,如‘綿麥 39’和‘綿麥 1403’,都是在四川綿陽(yáng)培育成的品種,都含有‘貴農(nóng)21-1’的血緣,且前者是春性小麥中早熟品種,后者是半春性早中熟品種,前者卻被聚到了I-1-1亞群,后者被聚到了第Ⅲ類群。這從側(cè)面反映出此39份抗銹材料的親緣較近,或者是采用的SSR位點(diǎn)與重要育種性狀的連鎖不緊密造成的。其余抗銹品種的聚類結(jié)果大多數(shù)符合血緣相近、生育期相似及育成地相同的原則。

本試驗(yàn)從219個(gè)小麥主栽品種中篩選出了39個(gè)抗銹品種,一類是由我國(guó)不同育成地的品種分別做父本和母本而培育出的抗銹品種,如‘洛麥 21號(hào)’,它是由‘洛麥 1號(hào)’做母本、‘周麥13’做父本雜交并通過(guò)系譜法選育而得到的抗銹品種,此次試驗(yàn)成株期抗銹性表現(xiàn)為中抗;類似的品種還有‘綿麥42’,它是由‘綿陽(yáng)96-5’和‘貴農(nóng)21-1’雜交系譜選育法培育出的品種,該品種已在綿陽(yáng)地區(qū)推廣數(shù)年,歷年的抗銹表現(xiàn)均為高抗或近免疫,屬于這一類的品種還有 ：‘新麥 19’、‘綿麥 39’、‘綿麥 185’、‘新麥18’、‘矮抗58’等。還有一類,是由國(guó)際抗銹品種與我國(guó)主栽品種雜交出的抗性品種,如‘蘭天22號(hào)’,它是由‘德國(guó)2號(hào)’和‘蘭天11號(hào)’雜交系譜選育法培育出的品種,在我國(guó)推廣多年抗銹性一直表現(xiàn)穩(wěn)定而良好,屬于這一類的品種還有：‘綿麥 37’、‘蘭天 15號(hào)’、‘蘭天20號(hào)’、‘西農(nóng) 88’、‘陜627’等。目前培育出的抗銹品種的血緣多數(shù)都是集中在少數(shù)幾個(gè)著名的國(guó)際材料上[9],致使多數(shù)抗銹材料血緣較為接近,如此一來(lái)會(huì)導(dǎo)致抗銹小麥品種遺傳多樣性的銳減,這提示我們培育小麥抗銹新品種應(yīng)針對(duì)不同地理位置采用不同的育種手法、制定不同的育種目標(biāo),不要集中在少數(shù)幾個(gè)著名的抗銹材料上。試驗(yàn)中篩選出的抗銹品種均包括我國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)的主栽品種的血緣,類似于這樣的抗銹品種的出現(xiàn)不僅填補(bǔ)了當(dāng)前我國(guó)小麥抗銹材料的空白,相比血緣集中在少數(shù)幾個(gè)國(guó)際抗銹材料上的品種而言,更增加了小麥抗銹材料的遺傳多樣性,對(duì)防治小麥條銹病的流行大有裨益。

圖1 40個(gè)小麥抗銹品種的聚類圖(品種編號(hào)與表1相同)

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