降解黃曲霉毒素枯草芽孢桿菌的解毒性、抗菌性及抗逆性研究

雷元培 趙麗紅 馬秋剛 鄭文革 高欣 計(jì)成

黃曲霉毒素（AFT）主要是由黃曲霉（Aspergillusflavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生的具有強(qiáng)烈毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)18種結(jié)構(gòu)衍生物，其中黃曲霉毒素B1毒性最大，其具有極強(qiáng)的致癌、致突變、致畸和免疫抑制性[2-3]。黃曲霉毒素廣泛存在于玉米、花生粕等飼料原料中，嚴(yán)重威脅動(dòng)物的生產(chǎn)性能，每年給飼料工業(yè)和畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。自1960年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，AFT已經(jīng)受到廣泛的重視，人們紛紛研究和采用各種方法來(lái)去除糧食和飼料中的AFT，其中包括各種物理、化學(xué)和微生物脫毒方法等[6-7]。然而，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)去除霉菌毒素的方法存在效果不穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)成分損失大、影響飼料適口性且難以規(guī)?；a(chǎn)等缺點(diǎn)而不能被廣泛應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。微生物及生物酶解毒因具有解毒效率高、特異性強(qiáng)、對(duì)飼料和環(huán)境沒(méi)有污染等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)而備受研究者的重視[8－9]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種嗜溫性好氧產(chǎn)芽孢革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，對(duì)人畜無(wú)毒、無(wú)害，不污染環(huán)境，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，能分泌多種抗生素和酶。枯草芽孢桿菌的商品制劑是國(guó)際公認(rèn)的可直接飼喂動(dòng)物的、安全級(jí)（GRAS）微生物制品，對(duì)動(dòng)物飼料酶制劑的開(kāi)發(fā)有很好的應(yīng)用前景。鑒于芽孢桿菌諸多功能特性，我們嘗試了從不同種類(lèi)芽孢桿菌中篩選對(duì)黃曲霉毒素有降解活性的菌株，從35株實(shí)驗(yàn)室分離并保藏的芽孢桿菌中得到一株對(duì)黃曲霉毒素有高效降解活性的菌，其發(fā)酵液對(duì)AFB1、AFG1和AFM1的降解率分別可達(dá)到81%、78%和63%。經(jīng)16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），根據(jù)其功能特性命名為霉立解060菌。本試驗(yàn)對(duì)篩選得到的能夠高效降解黃曲霉毒素B1、G1和M1的霉立解060菌的解毒活性、抗菌活性及抗逆性進(jìn)行研究，為將該株具有多功能特性的枯草芽孢桿菌應(yīng)用到動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)中提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

霉立解060菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis），本實(shí)驗(yàn)室從動(dòng)物腸道分離得到并保藏，該株菌已經(jīng)保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），保藏號(hào)為CGMCC NO.3440。同時(shí)，該株菌已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利并獲授權(quán)（專(zhuān)利號(hào)：ZL 200910242938.3）。

沙門(mén)氏菌（Salmonella Typhimurium）、大腸桿菌（Escherichia Coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus），本實(shí)驗(yàn)室保藏，作為試驗(yàn)用指示菌。

枯草菌619（對(duì)黃曲霉毒素沒(méi)有降解作用的另一株枯草芽孢桿菌），本實(shí)驗(yàn)室保藏，用于抑菌性和抗逆性對(duì)比試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)試劑與設(shè)備

黃曲霉毒素 B1、G1、M1購(gòu)于 Sigma 公司；LB 培養(yǎng)基（1000 ml）：胰蛋白胨 10 g、酵母浸粉 5 g、NaCl 10 g，pH 值 7.0～7.2，蛋白酶 K。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 霉立解060菌降解黃曲霉毒素活性組分的確定

采用50 ml/250 ml裝液量的LB培養(yǎng)基對(duì)霉立解060菌進(jìn)行接種，在37℃、200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h制得霉立解060菌發(fā)酵液。取5 ml發(fā)酵液，4℃離心20 min（8000 r/min），分離上清液與菌體，上清液于4℃?zhèn)溆?；離心后的菌體用蒸餾水洗滌，再離心，取菌體加入5 ml蒸餾水制得菌懸液備用；以同樣的方法再制備一份菌體，對(duì)菌體進(jìn)行破碎，然后溶于5 ml蒸餾水制成胞內(nèi)液，備用。

對(duì)制得的等量的發(fā)酵液、上清液、菌懸液及胞內(nèi)液對(duì)黃曲霉毒素B1、G1和M1的降解活性進(jìn)行測(cè)定。取800 μl霉立解060菌發(fā)酵液，加入200 μl黃曲霉毒素B1（500 μg/kg），在37℃黑暗的培養(yǎng)箱中反應(yīng)72 h；以等量的LB培養(yǎng)基加黃曲霉毒素B1為對(duì)照組；以同樣的方法向霉立解060菌發(fā)酵液中分別加入AFG1和AFM1進(jìn)行解毒反應(yīng)試驗(yàn)，用HPLC及柱后光化學(xué)衍生的方法分別對(duì)AFB1、AFG1和AFM1的降解率進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 霉立解060菌發(fā)酵液活性組分性質(zhì)的研究

對(duì)霉立解060菌發(fā)酵上清液分別進(jìn)行熱處理（100℃加熱10 min）和蛋白酶K處理（0.01 g/ml蛋白酶K與發(fā)酵上清液反應(yīng)2 h）。按上述方法進(jìn)行解毒反應(yīng)試驗(yàn)，研究解毒活性物質(zhì)的性質(zhì)。

1.3.3 黃曲霉毒素含量測(cè)定

黃曲霉毒素含量測(cè)定可分為3個(gè)步驟：萃取、凈化、檢測(cè)。首先使用甲醇：水（6：4）溶液對(duì)其進(jìn)行萃取，然后使用免疫親和柱對(duì)樣品殘留毒素進(jìn)行凈化提?。ǚ椒▍⒄彰庖哂H和柱使用說(shuō)明書(shū)）；最后用HPLC(柱后光化學(xué)衍生)對(duì)凈化提取得到的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

首先，應(yīng)當(dāng)制定促進(jìn)科技發(fā)展方面的立法。比如，我國(guó)制定《科技促進(jìn)法》、《科技人才促進(jìn)法》等促進(jìn)科技發(fā)展的法律，為科技發(fā)展提供制度環(huán)境。其次，應(yīng)當(dāng)完善已有的科技相關(guān)法律。比如，應(yīng)當(dāng)從促進(jìn)科技發(fā)展的角度出發(fā)，完善《著作權(quán)法》、《專(zhuān)利法》、《商標(biāo)法》、《網(wǎng)絡(luò)安全法》等，為科技創(chuàng)新保駕護(hù)航，同時(shí)維護(hù)科研人員的智慧成果，激發(fā)其創(chuàng)新的積極性。最后，制定和完善規(guī)范科技運(yùn)行的法律。比如，我國(guó)可以制定《科技倫理法》，對(duì)科技工作者和科學(xué)研究活動(dòng)提出倫理性要求，禁止他們從事有違社會(huì)倫理道德的科研活動(dòng)。另外，還可以制定法律禁止科學(xué)研究用于違法的行為。

HPLC檢測(cè)條件為流動(dòng)相甲醇：水=1：1；流速 1 ml/min；色譜柱 C18150 mm×4.6 mm，0.5 μm；激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣量 20 μl。

AFB1降解率(%)=[（對(duì)照組AFB1含量－處理組AFB1含量）/對(duì)照組 AFB1含量]×100。

AFG1和AFM1與AFB1降解率的檢測(cè)方法相同。

1.4 霉立解060菌的抗菌性與抗逆性試驗(yàn)

1.4.1 抗菌性試驗(yàn)

指示菌懸液制備時(shí)，用接種針從斜面上挑取少量的指示菌，分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)菌懸液的濃度為109CFU/ml左右。

采用平板擴(kuò)散的方法（Lyver等，1998；林東等，2001）[10-11]，將霉立解060菌或枯草菌619用接種棒取少許分別點(diǎn)種到倒好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中央，37℃培養(yǎng)24 h，然后把平板倒扣于盛一薄層氯仿的培養(yǎng)皿蓋上并熏蒸約30 min，以便殺死活細(xì)胞并能讓菌落固定于平板的表面，然后移去培養(yǎng)皿蓋并讓平板里的殘余氯仿徹底揮發(fā)20 min。在平板表面鋪一層剛培養(yǎng)好的指示菌培養(yǎng)液，均勻布滿(mǎn)后傾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于37℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察點(diǎn)種的芽孢桿菌周?chē)咕Φ拇笮『颓逦潭葋?lái)判斷受試菌對(duì)指示菌的抗菌能力。

1.4.2 抗逆性試驗(yàn)

芽孢懸液的制備方法：將霉立解060菌或枯草菌619培養(yǎng)液置于80℃水浴保溫15 min，離心收集芽孢，菌體用磷酸緩沖液洗滌兩次，最后復(fù)溶在緩沖液中即為芽孢懸液。

加熱處理試驗(yàn)：分別取保存好的霉立解060菌或枯草菌619菌液5 ml注入到離心管中，采用分級(jí)稀釋?zhuān)桨逋坎?。再將裝有剩余菌液的離心管置于80℃水浴鍋中加熱15 min，取加熱后的菌液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)桨逋坎肌Ｗ詈髮⒓訜崆昂图訜岷蟮钠桨寰?7℃條件下培養(yǎng)24 h，計(jì)算兩株芽孢桿菌加熱前后的活菌數(shù)。

模擬胃液的耐受性試驗(yàn)：模擬胃液的制備借鑒Huang等（2004）[12]的方法。取0.5 ml的菌液加入4.5 ml的模擬胃液中，并迅速在振蕩器上充分混和，然后置于37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。分別在0、2和4 h的時(shí)候取出培養(yǎng)液并立即計(jì)數(shù)殘存芽孢的活菌數(shù)。

模擬膽鹽的耐受試驗(yàn)：模擬膽鹽的制備借鑒Huang等（2004）[12]的方法。取0.5 ml的菌液加入4.5 ml的模擬膽鹽中，并迅速在振蕩器上充分混和，然后置于37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。分別在0、24 h的時(shí)候取出培養(yǎng)液并立即計(jì)數(shù)殘存芽孢的活菌數(shù)。

芽孢總數(shù)的測(cè)定：樣品用無(wú)菌生理鹽水10倍梯度稀釋?zhuān)x擇合適的稀釋梯度用于計(jì)數(shù)。采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，取0.5 ml稀釋液涂布在平板上，在37℃培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉立解 060菌發(fā)酵上清液對(duì) AFB1、AFG1和AFM1有較高的降解活性(見(jiàn)圖1)

圖1 霉立解060菌發(fā)酵液不同組分對(duì)黃曲霉毒素B1、G1和M1的降解率

由圖1可知，霉立解060菌發(fā)酵上清液對(duì)AFB1、AFG1和AFM1的降解活性最高，分別為73%、71%和59%；而菌懸液和胞內(nèi)液對(duì)黃曲霉毒素B1、G1和M1的降解率不高，僅在10%左右。因此，初步認(rèn)為霉立解060菌對(duì)黃曲霉毒素降解的活性物質(zhì)是一種胞外分泌物，主要存在于其發(fā)酵后的上清液中。

2.2 熱處理和蛋白酶K處理后霉立解060菌上清液對(duì) AFB1、AFG1和 AFM1降解活性(見(jiàn)圖 2)

圖2 霉立解060菌發(fā)酵后的上清液熱處理和蛋白酶K處理后對(duì)AFB1、AFG1和AFM1的降解率

由圖2可知，霉立解060菌發(fā)酵后的上清液經(jīng)熱處理和蛋白酶K處理后其對(duì)黃曲霉毒素的降解率顯著降低，發(fā)酵后的上清液經(jīng)熱處理后對(duì)AFB1、AFG1和AFM1的降解率分別降低為20%、15%和17%，經(jīng)蛋白酶K處理后分別降低為34%、28%和19%。因此，可初步判斷霉立解060菌對(duì)黃曲霉毒素的降解活性物質(zhì)是一種細(xì)胞所產(chǎn)胞外酶。

2.3 霉立解060菌抑菌性測(cè)定(見(jiàn)表1)

表1 霉立解060菌對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性

由表1可知，霉立解060菌對(duì)大腸桿菌有顯著的抑制活性，其抑菌圈直徑為0.98 cm，而枯草菌619對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抑制作用，抑菌圈直徑為0；盡管枯草菌619對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑比霉立解060菌的大，但由于其沒(méi)有抑制大腸桿菌的活性，因此，霉立解060菌是一株對(duì)多種有害菌有抑制作用、抑菌性強(qiáng)的有益微生物。

2.4 霉立解060菌抗逆性測(cè)定

模擬胃液對(duì)霉立解060菌活性的影響見(jiàn)表2。由表2可知，在模擬胃液條件下，霉立解060菌活菌數(shù)比枯草菌619活菌數(shù)高；與0 h活菌數(shù)相比，霉立解060菌經(jīng)2 h和4 h模擬胃液處理后活菌數(shù)沒(méi)有顯著變化，活菌數(shù)仍達(dá)到98.83%和97.95%，說(shuō)明霉立解060菌對(duì)胃酸具有很強(qiáng)的耐受性。

表2 模擬胃液對(duì)霉立解060菌活性的影響

模擬膽鹽對(duì)霉立解060菌耐受性的影響見(jiàn)表3。由表3可知，在模擬膽鹽的條件下，霉立解060菌0 h和24 h的活菌數(shù)沒(méi)有顯著變化（P＞0.05），模擬膽鹽處理24 h后其活菌數(shù)仍然能達(dá)到96.03%；而枯草菌619經(jīng)膽鹽處理24 h后活菌數(shù)為0，對(duì)膽鹽沒(méi)有耐受能力，進(jìn)一步說(shuō)明霉立解060菌是一株對(duì)膽鹽具有很好耐受性的菌。

表3 霉立解060菌對(duì)膽鹽耐受性試驗(yàn)結(jié)果

霉立解060菌對(duì)高溫耐受性試驗(yàn)的研究結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，霉立解060菌在80℃加熱15 min后活菌數(shù)沒(méi)有變化（P＞0.05），其活菌數(shù)仍能達(dá)到98.69%；枯草菌619在經(jīng)過(guò)80℃加熱后，活菌數(shù)為0，結(jié)果表明，霉立解060菌對(duì)80℃高溫具有很好的耐受性，適合作為動(dòng)物用飼料添加劑。

表4 霉立解060菌對(duì)高溫耐受性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

霉立解060菌是課題組從動(dòng)物腸道分離得到的，進(jìn)一步研究表明，該株枯草芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素降解的活性組分存在于發(fā)酵上清液中，菌懸液和胞內(nèi)液對(duì)黃曲霉毒素的降解率很低。發(fā)酵上清液經(jīng)熱處理和蛋白酶K處理后對(duì)黃曲霉毒素的降解率顯著降低，初步認(rèn)為霉立解060菌對(duì)黃曲霉毒素的解毒活性物質(zhì)是一種細(xì)胞所產(chǎn)胞外酶。眾所周知，枯草芽孢桿菌酶是工業(yè)酶市場(chǎng)的主體，其生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶是工業(yè)酶中應(yīng)用最為廣泛的酶，僅這兩種酶就占了整個(gè)工業(yè)酶市場(chǎng)的50%[13]。目前報(bào)道的能夠降解黃曲霉毒素的細(xì)菌不多，有橙色黃桿菌(Flavobacterium aurantiacum)[14]、分支桿菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）[15]、紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）[16]及橙紅色粘球菌（Myxococcus fulvus）[17]等。這些菌如果要應(yīng)用到動(dòng)物生產(chǎn)中還需要對(duì)其做進(jìn)一步的安全性評(píng)價(jià)，而枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)部允許直接添加到動(dòng)物飼料中的有益微生物，因此芽孢桿菌霉立解060菌及其所產(chǎn)的毒素降解酶具有非常大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

為進(jìn)一步研究霉立解060菌的抑菌特性和抗逆活性，將該株菌應(yīng)用到動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)中，盡可能地發(fā)揮該菌的功能特性，我們對(duì)霉立解060菌和另外一株對(duì)黃曲霉毒素沒(méi)有降解作用的枯草芽孢桿菌進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究。動(dòng)物腸道環(huán)境復(fù)雜，腸道菌群多樣性變化，除附殖有益微生物(乳酸菌、芽孢桿菌、腸球菌)外，還包含有害微生物，如大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等，進(jìn)入動(dòng)物腸道的有益微生物若能較好的發(fā)揮其功能，必須要抵抗各種不利因素，包括抵抗有害菌的抑制作用。通過(guò)以這三株菌為指示菌，以另外一株對(duì)黃曲霉毒素沒(méi)有解毒活性的枯草菌619做對(duì)比，研究了霉立解060菌的抑菌活性，結(jié)果表明，霉立解060菌對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑菌活性，可以抵抗動(dòng)物腸道有害菌的不利影響而發(fā)揮正常的生理功能。試驗(yàn)結(jié)果還表明，并不是所有的枯草芽孢桿菌都對(duì)多種有害菌同時(shí)具有抑菌活性。

目前，有益微生物均以口服方式飼喂動(dòng)物，因此，它們必須首先具備耐受胃的低pH值的能力才可能進(jìn)入動(dòng)物腸道存活、繁殖，發(fā)揮其作用。除應(yīng)具備耐胃低pH值能力外，還需具備耐受小腸中膽鹽等形成的高滲透壓環(huán)境的能力?？莶菅挎邨U菌等益生菌株在菌液濃縮或制作膨化顆粒料時(shí)，都要進(jìn)行加熱處理,對(duì)高溫的耐受性也成為選擇有益微生物的必備條件[18]。因此，試驗(yàn)對(duì)霉立解060菌株進(jìn)行了模擬胃液、膽鹽及熱耐受試驗(yàn)。結(jié)果表明，與另外一株對(duì)黃曲霉毒素沒(méi)有解毒活性的枯草芽孢桿菌相比，霉立解060菌除具有降解黃曲霉毒素的特性外，還能顯著抑制動(dòng)物腸道有害菌的繁殖，同時(shí)抵抗胃酸、膽鹽、高溫等不利環(huán)境而正常生長(zhǎng)。因此，霉立解060菌具備良好的開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

課題組從動(dòng)物腸道分離篩選到的枯草芽孢桿菌（霉立解060菌）對(duì)黃曲霉毒素B1、G1和M1具有較高的降解活性；初步試驗(yàn)證明，解毒活性物質(zhì)是該菌分泌的一種胞外蛋白酶；同時(shí)，霉立解060菌具有很好的抑菌活性和抗逆性，非常適合用于動(dòng)物飼料微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

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