致敏樹突狀細(xì)胞疫苗抗小鼠乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究

黃宏思 黃衍強(qiáng) 韋連登

（右江民族醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西 百色 533000）

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是目前已知的人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的、能唯一激活靜息期T細(xì)胞的專職抗原呈遞細(xì)胞，具有強(qiáng)大的激活CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）及CD4+輔助性T細(xì)胞的能力。近年來，以DC為基礎(chǔ)的免疫治療作為一種主動(dòng)特異性細(xì)胞免疫治療，逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外的醫(yī)學(xué)研究者嘗試在體外用多種腫瘤抗原致敏DC，然后將其回輸體內(nèi)，望以此打破宿主對(duì)腫瘤的耐受，激發(fā)針對(duì)腫瘤的主動(dòng)特異性細(xì)胞免疫。本實(shí)驗(yàn)采用將小鼠EMT6乳腺癌細(xì)胞株注射到BALB/c小鼠皮下的方法建立小鼠乳腺腫瘤模型，然后觀察乳腺癌抗原致敏樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)小鼠移植瘤是否有抗腫瘤作用[1-4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株

BALB/c雌性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠EMT6乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

1.1.2 主要試劑及儀器

含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）和重組小鼠白細(xì)胞介素4（rmIL-4）等購(gòu)自美國(guó)Biosouce。LDH試劑盒購(gòu)自南京建成公司。酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DC的分離及培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[2]采用骨髓分離法并稍作改進(jìn)。取BALB/c小鼠頸椎脫臼法處死：浸入75%酒精中5～10min，無菌手術(shù)取出股骨；剪去長(zhǎng)骨骨端，沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白；收集骨髓細(xì)胞，低滲分離去除紅細(xì)胞，洗滌離心后用RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，沖洗后按500U/mL rmGM-CSF和200U/mL rmIL-4的終濃度加入培養(yǎng)體系，37℃、5%CO2培養(yǎng)備用。

1.2.2 DC疫苗的制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT6細(xì)胞反復(fù)凍融[5,6]獲得腫瘤細(xì)胞凍融粗提全抗原，于-20℃保存?zhèn)溆谩０碊C與腫瘤細(xì)胞為1∶3的比例向DC培養(yǎng)瓶中加入腫瘤細(xì)胞凍融抗原，繼續(xù)培養(yǎng)48h，此時(shí)的DC即為經(jīng)腫瘤抗原致敏的DC疫苗。

1.2.3 檢測(cè)DC誘導(dǎo)CTL的殺傷活性

將24只小鼠隨機(jī)分成4組，每組6只。分別在每組小鼠皮下分別注射PBS、凍融腫瘤抗原、未致敏DC和致敏DC，免疫7d后處死小鼠，無菌收集脾臟淋巴細(xì)胞作為CTL效應(yīng)細(xì)胞，另取EMT6細(xì)胞為靶細(xì)胞，將效：靶細(xì)胞按100∶1、50∶1和25∶1的比例置于96孔板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h。采用定量乳酸脫氫酶（LDH）法檢測(cè)CTL殺傷活性，本實(shí)驗(yàn)復(fù)3次，D波長(zhǎng)490nm。

CTL殺傷率=（實(shí)驗(yàn)組D值-自然釋放組D值）/最大釋放組D值×100%。

1.2.4 荷瘤小鼠模型的建立

凍存EMT6細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)并傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%，傾去培養(yǎng)液，Hanks液漂洗。2.5g/L胰蛋白酶37℃消化至細(xì)胞皺縮變圓。傾去胰酶，加入無血清培養(yǎng)基輕柔吹打形成細(xì)胞懸液，離心800r/min 3min。棄上清，再次加入無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞，檢測(cè)活細(xì)胞比例大于95%，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL。

1.2.5 體內(nèi)抑瘤效果檢驗(yàn)

將32只小鼠隨機(jī)分成4組，每組8只。實(shí)驗(yàn)第1d，于各小鼠右前腋下皮下接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT6細(xì)胞（1×106個(gè)/只）。次日，于各組小鼠同側(cè)右前腋下皮下分別注射PBS、凍融腫瘤抗原、未致敏DC和腫瘤抗原致敏的DC疫苗，注射劑量為1×106個(gè)DC/只。然后于第7d和第14d分別強(qiáng)化注射1次，劑量同上。當(dāng)皮下腫瘤可觸及后，用卡尺測(cè)量腫瘤的縱徑和橫徑，通過公式1/6πab2估算腫瘤體積（a為長(zhǎng)軸縱徑，b為短軸縱徑）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DC誘導(dǎo)CTL的殺傷活性的檢測(cè)

當(dāng)效：靶比為100∶1時(shí)，與PBS對(duì)照組比較，抗原致敏的DC細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL體外對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用；而未經(jīng)抗原致敏的DC組和單純腫瘤抗原組與PBS對(duì)照組間無顯著性差異。見表1。

表1 CTLs對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性（±s，n=9，D490）

表1 CTLs對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性（±s，n=9，D490）

注：*：與PBS對(duì)照組比較，P＜0.05；#：與PBS對(duì)照組比較，P＞0.05

組別 EMT6 100∶1 50∶1 25∶1 PBS對(duì)照組 17.3±3.7 10.5±4.3 5.7±3.8未經(jīng)抗原致敏DC組 20.7±4.9# 16.7±5.2 11.9±4.7單純腫瘤抗原組 26.4±5.2# 20.4±4.3 9.5±3.6抗原致敏DC組 40.8±5.6* 35.6±5.4 24.6±5.7

2.2 DC疫苗體內(nèi)抗腫瘤效果檢測(cè)

觀察小鼠荷瘤21d。腫瘤抗原致敏DC免疫小鼠組的腫瘤生長(zhǎng)得到明顯抑制，體積為（0.248±0.027），與PBS對(duì)照組（0.826±0.061）間有顯著性差異；而單純腫瘤抗原組及未致敏DC免疫小鼠組，雖然腫瘤也得到一定的抑制，但與PBS對(duì)照組間無顯著性差異。見表2。

表2 DC疫苗對(duì)荷瘤小鼠的抗腫瘤作用（±s，n=9）

表2 DC疫苗對(duì)荷瘤小鼠的抗腫瘤作用（±s，n=9）

注：*：與PBS對(duì)照組比較，P＜0.05；#：與PBS對(duì)照組比較，P＞0.05

腫瘤體積（cm3）組別 7d 14d 21d 28d PBS對(duì)照組 0.121±0.0620.265±0.057 0.826±0.061 1.004±0.071未經(jīng)抗原致敏DC組 0.153±0.0480.169±0.0720.714±0.059#0.837±0.053單純腫瘤抗原組 0.109±0.0760.237±0.054 0.607±0.062#0.752±0.065抗原致敏DC組 0.051±0.0430.112±0.0360.248±0.027*0.392±0.041

3 討 論

樹突狀細(xì)胞（DC）是由美國(guó)學(xué)者Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前所知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，它具有激發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)對(duì)自身抗原耐受等功能。DC系統(tǒng)作為機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答的始動(dòng)子和調(diào)節(jié)子，具有強(qiáng)大的激活CD8+CTL和CD4+輔助性T細(xì)胞的能力，控制著體內(nèi)免疫應(yīng)答的過程，因而成為抗腫瘤免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。近年來，隨著體外大量擴(kuò)增DC和制備DC疫苗技術(shù)的日趨成熟，采用DC疫苗進(jìn)行抗腫瘤治療，包括抗乳腺腫瘤治療已成為當(dāng)今腫瘤生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點(diǎn)之一[7-9]。

單純的抗原不能活化T淋巴細(xì)胞，必須經(jīng)過抗原提呈細(xì)胞（APC）攝取、加工和遞呈，因?yàn)門淋巴細(xì)胞活化需要抗原和輔助分子雙信號(hào)才能有效地誘導(dǎo)CTL形成，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。而腫瘤細(xì)胞可通過下調(diào)腫瘤相關(guān)抗原、低表達(dá)或不表達(dá)MHC分子和共刺激分子，使抗原不能被有效遞呈給T細(xì)胞以產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)，因此激發(fā)有效的T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答是提高腫瘤免疫治療效果的關(guān)鍵。負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗由于可通過DC表面MHC類分子、共刺激分子將腫瘤相關(guān)抗原信息有效地遞呈給T細(xì)胞，因此作為理想的腫瘤疫苗在實(shí)驗(yàn)和臨床研究受到廣泛重視[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤抗原致敏DC免疫后小鼠可產(chǎn)生腫瘤特異性CTL，從而有效殺傷腫瘤細(xì)胞；而單純腫瘤抗原或未經(jīng)抗原致敏的DC免疫后小鼠則不能產(chǎn)生足夠的具有殺傷腫瘤作用的特異性CTL。經(jīng)過3周DC疫苗免疫治療，腫瘤抗原致敏DC治療組小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)得到明顯抑制，與PBS對(duì)照組比較，差異有顯著性。由此推斷，DC疫苗治療乳腺癌是一種有效的方法，有望成為乳腺癌免疫治療的新方法。

[1]Dallal RM,Lotze MT.The dendritic cell and human cancer vaccines[J].Curr Opin Immunol,2000,12(5):583-588.

[2]Inaba K,Inaba M,Romani N.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with GM-CSF[J].J Exp Med,1992,176(6):1693.

[3]Nestle FO,Burg G,Dummer R.New perspectives on immunobiology and immunotherapy of melanoma[J].Immunol Today,1999,20(1):5-7.

[4]曹雪濤.樹突狀細(xì)胞的基礎(chǔ)與臨床研究新進(jìn)展[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,1998,14(3):161.

[5]唐華,銀平章,孔令非,等.凍融抗原沖擊致敏的樹突狀細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌小鼠的治療作用[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2000,7(3):199-202.

[6]高維實(shí),閔軍,褚忠華,等.肝癌細(xì)胞凍融抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞疫苗的制備與活化[J].中國(guó)病理生理雜志,2003,19(9):1279-1282.

[7]Schuler G,Steimman RM.Dendritic cells as a adjuvants for immunemediated resistance to tumor[J].J EXP Med,1997,186(8):1183-1187.

[8]Banchereau J,Steimman RM.Dendritic cells and the control of immunity[J].Nature,1998,392(6673):245-252.

[9]Zitvogel L,Femandez N,Lozier A,et al.Dendritic cells of their exosmes are effective biotherapies of cancer[J].Eur J Cancer,1999,35(suppl3):36-38.

[10]Yamanaka R,Homma J,Tsuchiya N,et al.Tumorlysate and IL-18 loaded deneritic cells elicits Th1 response tumor specific CD+8cytotoxic T cells in patients with maligmant glioma[J].J N eurooncol,2005,72(2):107-113.