利用珍貴橙色束絲放線菌ATCC 31565氨甲?；?,5-雙氫-7-去氨甲酰基格爾德霉素

劉昕，李書芬，牛沂菲，賈長虹，武臨專，王以光

格爾德霉素（geldanamycin，GDM）和安絲菌素（ansamitocin，ASM）分別是由吸水鏈霉菌（如streptomyces hygroscopicus17997）和珍貴橙色束絲放線菌（如actinosynnema pretiosumATCC 31565）產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的安莎類抗生素[1-2]。GDM 與 ASM 具有相同的生物合成機制：它們均以 3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）為特異性生物合成起始物，在 I 型聚酮合酶（PKS）作用下將 7 個二碳單位連接形成安莎鏈，在酰胺合酶的作用下將安莎鏈與AHBA 連接環(huán)化；再經(jīng)過 PKS 后修飾過程，形成 GDM 或ASM[3-4]。但是，GDM 與 ASM 的生物合成 PKS 后修飾存在顯著差異：GDM 的 PKS 后修飾包括羥基化、O-甲基化、氨甲?；脱趸?，ASM 的 PKS 后修飾包括鹵（氯）化、N-甲基化（或 N-糖基化[5]）、O-甲基化、?；h(huán)氧化和氨甲?；ōh(huán)化）等（圖1）。相對于 GDM，ASM 的 PKS后修飾似乎更加復(fù)雜。如果參與 ASM 生物合成的 PKS 后修飾系統(tǒng)可對 GDM 生物合成中間產(chǎn)物（或 GDM 本身）發(fā)揮修飾作用，就可獲得新的格爾德霉素衍生物，從而為抗腫瘤藥物開發(fā)提供候選化合物。基于該設(shè)想，本文作者進行了初步的探索研究。

圖1 ASM 與 GDM 具有相同的生物合成機制、不同的 PKS 后修飾示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565，ASM 產(chǎn)生菌；吸水鏈霉菌 17997，GDM 產(chǎn)生菌；吸水鏈霉菌 17997gdmN（氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因）阻斷變株，4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基格爾德霉素（4,5-dihydro-7-descarbomoyl-7-hydroxygeldanamycin，CT-1-7）產(chǎn)生菌[6-7]；吸水鏈霉菌17997gdmP（細胞色素 P450 單氧化酶基因）基因阻斷變株，4,5-雙氫格爾德霉素（4,5-H2GDM）產(chǎn)生菌（同時產(chǎn)生少量 17-O-demethylreblastatin）[8-9]。上述菌株均為本實驗室保存或構(gòu)建。

1.1.2 試劑 GDM、CT-1-7、4,5-H2GDM 和 17-O-demethylreblastatin，由本實驗室分別從吸水鏈霉菌 17997、吸水鏈霉菌 17997gdmN阻斷變株、吸水鏈霉菌 17997gdmP阻斷變株的發(fā)酵產(chǎn)物中提??；GF254TLC 硅膠板為青島海洋化工分廠產(chǎn)品；葡萄糖、乙酸乙酯等普通化學(xué)試劑為北京化工廠化學(xué)或分析純產(chǎn)品；甲醇為美國 Fisher 公司HPLC 級產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀為美國 Agilent公司產(chǎn)品；QTRAP 型質(zhì)譜為美國 Applied Biosystems/MSD SCIEX 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 的培養(yǎng) 甘油管冷凍保藏的珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 孢子懸液，接種于 MY 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基組成：酵母提取物 0.4%，麥芽提取物 1.0%，葡萄糖 0.4%，瓊脂粉 1.5%），28℃培養(yǎng) 4～5 d。

1.2.2 生物轉(zhuǎn)化 珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 的每個 MY 培養(yǎng)平皿（直徑 9cm），加入 CT-1-7 溶液（溶于二甲基亞砜，20 mg/ml）250 μl，終濃度 200 μg/ml，涂勻，28℃繼續(xù)培養(yǎng) 24～36 h。

1.2.3 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取 取一個生物轉(zhuǎn)化平皿，將其中的 MY 瓊脂培養(yǎng)物切碎為長寬約 0.5cm×0.5cm 大小的瓊脂塊，轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入約 40 ml 乙酸乙酯提取 24 h，傾出提取液，室溫揮干后，用約 500 μl 乙酸乙酯復(fù)溶。

1.2.4 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測 硅膠板 TLC 檢測，采用乙酸乙酯-二氯甲烷-正己烷-甲醇（9∶6∶6∶1）溶媒系統(tǒng)展層；展層結(jié)束后，用少量 NaOH（2.0 mol/L）溶液噴涂[10]，照相記錄。

1.2.5 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的 LC-MS/MS 分析 將目標生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物從 TLC 硅膠板上刮下，乙酸乙酯洗脫回收并揮干，復(fù)溶于少量甲醇中，進行 LC-MS/MS 分析。Agilent 1200 型液相色譜系統(tǒng)與 QTRAP LC-MS-MS 質(zhì)譜儀聯(lián)用，配Turbo Ionspray 離子化源。液相色譜條件：Dikma Diamonsil C18反相色譜柱，5 μm，150mm×4.6mm；30%～100%甲醇梯度洗脫 30min；流速 1 ml/min；檢測波長 304 nm。質(zhì)譜檢測條件：噴霧電壓 5.5 kV；溫度 450℃；解簇電壓 80 V；霧化氣 40 相對單位，輔助氣 30 相對單位，均為氮氣；全掃描監(jiān)測，正離子方式，質(zhì)荷比（m/z）范圍為100～1000；采用信息依賴掃描模式獲得二級質(zhì)譜；碰撞壓力設(shè)為高；碰撞能量為35 eV。

2 結(jié)果

2.1 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 TLC 檢測結(jié)果

對 4,5-雙氫-7-去氨甲酰基-7-羥基格爾德霉素（CT-1-7，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2）。在珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 中的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行硅膠板 TLC 和 NaOH 顯色，發(fā)現(xiàn)有新的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物出現(xiàn)（圖3），并且與 4,5-H2GDM 具有相同的Rf值。

圖2 CT-1-7（左）和 4,5-H2GDM（右）的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖3 CT-1-7 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的硅膠板 TLC 檢測

2.2 LC-MS/MS 分析結(jié)果

圖4 4,5-H2GDM 的 LC-MS/MS 確證

從 TLC 硅膠板上回收轉(zhuǎn)化產(chǎn)物條帶后進行 HPLC 分析，主峰的保留時間（24.47min）和紫外吸收光譜（圖4A）與 4,5-H2GDM 對照品一致，因此推測該化合物為4,5-H2GDM；對該化合物進行質(zhì)譜分析（圖4B），顯示其分子量和二級質(zhì)譜特征均與 4,5-H2GDM 一致[11]，證實該化合物為4,5-H2GDM，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

3 討論

Hu 等[12]利用除莠霉素（herbimycin）與 GDM 的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性，在除莠霉素產(chǎn)生菌——Streptomyces hygroscopicusAM 3672 中對 GDM 進行了生物轉(zhuǎn)化研究，獲得了格爾德霉素衍生物——15-羥基格爾德霉素。本文將 GDM 生物合成中間產(chǎn)物 4,5-雙氫-7-去氨甲酰基-7-羥基格爾德霉素（CT-1-7）加入到 ASM 產(chǎn)生菌——珍貴橙色束絲放線菌Actinosynnema pretiosumATCC 31565 中，獲得了 4,5-雙氫格爾德霉素，說明參與 ASM 生物合成 PKS 后修飾的氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶能夠識別并催化 CT-1-7 氨甲?；?。此外，本文作者還分別利用珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 對GDM 以及另外一個 GDM 生物合成中間產(chǎn)物（17-O-demethylreblastatin，即 17-hydroxy-progeldanamycin）[13]進行了生物轉(zhuǎn)化實驗，但未檢測到生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，提示安絲菌素生物合成 PKS 后修飾除了氨甲酰基化以外的其他修飾步驟不能對格爾德霉素及其生物合成中間產(chǎn)物發(fā)生作用。考慮到前格爾德霉素（progeldanamycin，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）與前安絲菌素（proansamitocin，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）在結(jié)構(gòu)上非常相似，今后如可獲得前格爾德霉素，還可采用前格爾德霉素作為生物轉(zhuǎn)化底物，探討獲得格爾德霉素衍生物（雜合抗生素）的可能性。

CT-1-7 在珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 中的氨甲酰基化產(chǎn)率較低（約 5%～10%），推測主要是由于在珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 中存在 ASM 生物合成中間產(chǎn)物的競爭作用；預(yù)計阻斷 ASM 生物合成，可顯著提高其氨甲酰基化產(chǎn)率。

對參與 GDM 與 ASM 生物合成 PKS 后修飾的氨甲?；D(zhuǎn)移酶進行氨基酸序列比對（alignment），發(fā)現(xiàn)兩者有60%相同性（identities）、70%相似性（positives），因此，推測這兩個酶在空間結(jié)構(gòu)上非常相似；由于兩者所催化底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)又比較相似，它們在催化功能上可以互相替換并不令人意外，本文的生物轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果對此予以了證實。

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