EGFR、VEGF和PTEN在結(jié)直腸癌中表達(dá)及與其臨床病理特征的關(guān)系

谷化平 尚培中

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。大量研究表明，結(jié)直腸癌的形成和轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個多基因、多因子共同作用的結(jié)果。我們采用免疫組化方法，探討表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelil growth factor,VEGF)和張力蛋白同源物基因(phoshatase and tension homology deleted on chromosome fen,PTEN)蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，及EGFR、VEGF與 PTEN蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性，為預(yù)測結(jié)直腸癌浸潤轉(zhuǎn)移提供客觀參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 選取我院2004年～2010年手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌標(biāo)本98例(結(jié)腸癌57例，直腸癌41例)，男性67例，女性31例，平均年齡(52.4±11.8)歲。取20例同期患者遠(yuǎn)癌切緣處正常大腸黏膜組織(距癌灶>4cm)作為對照組。標(biāo)本均經(jīng)40 g/L中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.1.2 試劑 鼠抗人EGFR、VEGF、PTEN抗體和LSAB試劑盒購自邁新生物技術(shù)公司(均為即用型)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 采用微波-鏈霉菌素-生物素(MW-LSAB)免疫組織化學(xué)法和應(yīng)用微波-金屬鹽抗原修復(fù)技術(shù)。即切片常規(guī)脫蠟水化后,放入枸櫞酸緩沖液(10 mmol/L，pH 6.0)內(nèi),用微波儀(YWY781A醫(yī)用型)170 W輻射5 min,冷卻后水洗。其他操作流程同常規(guī)LSAB法,所不同者為三步抗原孵育和正常血清封閉用微波儀130 W分別輻射5 min,保溫2 min即可。實驗用已知EGFR、VEGF和 PTEN表達(dá)陽性的胃癌組織作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。H2O2-DAB顯色。

1.2.2 結(jié)果判斷 EGFR以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，VEGF以細(xì)胞質(zhì)、PTEN以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞比例分為4級：無陽性細(xì)胞為陰性(-);陽性細(xì)胞數(shù)<25%為弱陽性(+)，25%～75%為陽性(++)，>75%為強陽性(+++)；(+)以上為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用χ2檢驗比較組間陽性率差異。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、VEGF和 PTEN蛋白在結(jié)直腸癌和正常腸黏膜組織中的表達(dá)

EGFR、VEGF和 PTEN陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色。EGFR陽性定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，結(jié)直腸癌組織中其陽性表達(dá)率為61.2%(60/98)，正常腸黏膜組織中未見陽性表達(dá)(0,0/20)，差異有顯著性(χ2=21.05,P<0.05)；VEGF陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，結(jié)直腸癌組織中其陽性表達(dá)率為66.3%(65/98)，正常腸黏膜組織中陽性表達(dá)率為15.0%(3/20)，差異有顯著性(χ2=15.90,P<0.05)；PTEN陽性定位于細(xì)胞核(圖3)，結(jié)直腸癌組織中其陽性表達(dá)率為48.0%(47/98)，正常腸黏膜組織中其陽性表達(dá)率為100.0%(20/20)，差異有顯著性(χ2=14.72,P<0.05)。

2.2 EGFR、VEGF和 PTEN蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

EGFR、VEGF和PTEN蛋白陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤部位、大小、分化程度無關(guān)(P>0.05)，而與結(jié)直腸癌Dukes分期、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 EGFR、VEGF和 PTEN蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌組織中EGFR、VEGF和 PTEN表達(dá)間的關(guān)系

EGFR表達(dá)陽性的60例結(jié)直腸癌組織中，VEGF和 PTEN陽性表達(dá)例數(shù)分別為47例(78.3%)和18例(30.0%)；EGFR陰性表達(dá)的38例結(jié)直腸癌組織中，VEGF和 PTEN陽性表達(dá)例數(shù)分別為19例(50.0%)和29例(76.3%)；EGFR陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中VEGF陽性表達(dá)率高于EGFR陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織，差異有顯著性(χ2=8.36,P<0.05)，而PTEN陽性表達(dá)率低于EGFR陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織，差異有顯著性(χ2=19.73,P<0.05)；VEGF陽性表達(dá)的65例結(jié)直腸癌組織中，PTEN陽性表達(dá)20例 (30.8%)；VEGF陰性表達(dá)33例中，PTEN陽性表達(dá)27例(81.8%)；VEGF表達(dá)陽性的結(jié)直腸癌組織中PTEN陽性表達(dá)率低于VEGF陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織，差異有顯著性(χ2=22.85,P<0.05)。

3 討論

EGFR屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族，其家族成員包括EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4 4種同源受體。EGFR廣泛表達(dá)于表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞、部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和組織修復(fù)中起著十分重要作用，其信號系統(tǒng)所引起的細(xì)胞效應(yīng)包括細(xì)胞增殖、遷移及黏附等多個環(huán)節(jié)。EGFR作為1種腫瘤標(biāo)志具有許多有點，主要表現(xiàn)為EGFR基因在許多上皮來源的腫瘤組織中呈表達(dá)或過表達(dá)改變，EGFR的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[1,2]。EGFR在頸部鱗癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、卵巢癌及膀胱癌等上皮性腫瘤中均有表達(dá)及過表達(dá)，并與其腫瘤的臨床進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[3，4],它的失調(diào)與腫瘤對化療和放療的耐受以及不良預(yù)后相關(guān)，為腫瘤的治療提供了一個理想的分子靶點[5]。本研究結(jié)果顯示，在98例結(jié)直腸癌組織中EGFR表達(dá)陽性率為61.2%，顯著高于正常腸黏膜組織,并隨著Dukes分期增高、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平亦隨著顯著性增高。提示，EGFR表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)行為和臨床進(jìn)展密切相關(guān)，高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志。

VEGF是迄今所發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子，它可通過血管內(nèi)皮上的受體(VEGFR)介導(dǎo)的受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和管腔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)退化，增加血管滲透性。VEGF在正常成人與動物組織中表達(dá)水平較低，但在胎兒及正在進(jìn)行生理性血管生長的組織中表達(dá)水平較高。VEGF在腫瘤中表達(dá)水平較高，它可促使腫瘤血管生成，在維持腫瘤的持續(xù)生長中起著重要作用，同時也是腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[6]，因此VEGF表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移情況、微血管密度等呈正相關(guān)，與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。以VEGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點進(jìn)行腫瘤靶向治療已在多種腫瘤中取得了實質(zhì)性的療效。本研究結(jié)果顯示，在98例結(jié)直腸癌組織中VEGF表達(dá)陽性率為66.3%，顯著高于正常腸黏膜組織,并隨著Dukes分期增高、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平亦隨著顯著性增高。提示，VEGF主要在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，臨床上檢測VEGF表達(dá)對預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能和指導(dǎo)治療方面具有較大實用價值，是1個預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要生物學(xué)參考指標(biāo)。

PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第1個具有磷酸酶活性的抑癌基因。通過結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，PTEN與細(xì)胞骨架蛋白和張力蛋白高度同源，提示PTNE可能參與細(xì)胞骨架重組并影響細(xì)胞遷移能力。當(dāng)PTEN抑癌基因突變或缺失可能構(gòu)成1個新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生和死亡、細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和黏連等方面均起重要作用，與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[7]。PTEN突變或缺失可以促進(jìn)血管內(nèi)皮因子的形成，使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤微血管的形成，從而使腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力增高[8]。本研究結(jié)果顯示,PTEN蛋白表達(dá)陽性率在結(jié)直腸癌中顯著低于正常腸黏膜組織,并隨著Dukes分期增高、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平亦隨著顯著性減低。提示，PTEN的丟失與結(jié)直腸癌的發(fā)生、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，在其腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著重要的抑制作用，可能是結(jié)直腸癌的發(fā)生和臨床進(jìn)展過程中的晚期事件。在臨床病理活檢中，檢測其基因蛋白表達(dá)有助于深入了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可作為早期診斷、預(yù)后判斷和評價腫瘤生物學(xué)行為的客觀指標(biāo)，尤其對指導(dǎo)臨床采用基因治療提供依據(jù)及新思路更具有重要意義。

在惡性腫瘤發(fā)生的癌基因研究中，許多學(xué)者提出了基因協(xié)同作用假說，認(rèn)為在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各階段，至少有2個或2個以上功能不同的異常激活的基因各自發(fā)揮不同作用，并在時間和空間上相互配合，協(xié)同促進(jìn)了細(xì)胞的癌變。有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤的演進(jìn)過程中，EGFR能通過增加VEGF表達(dá)或與其協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管形成，去除EGFR的作用會阻礙血管的進(jìn)一步發(fā)生[9]，而PTEN可通過調(diào)節(jié)VEGF來抑制腫瘤細(xì)胞的運動性和血管形成[10]。本結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌中EGFR和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，兩者表達(dá)與PTEN表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。表明在結(jié)直腸癌的系列病理過程中，EGFR、VEGF與PTEN具有相互協(xié)同效應(yīng)，其機(jī)理有待進(jìn)一步深入探討。

[1] Tamas P,Solti Z,Bauer P,et al.Mechanism of epiclermal growth factor regulation of Vav2,a guanine nucleotide exchange factor for rac〔J〕.Biol Chem,2003,32(7):378.

[2] 戴春玲，符立梧.靶點藥物Cetuxinab(C225)研究新進(jìn)展〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007,34(3):246.

[3] Carneiro A,Isinger A,Karlsson A,et al.Pprognostic impact of array-based genomic profiles in esophageal squamous cell cancer〔J〕.BMC Cancer,2008,11(8):98.

[4] Matkovic B,Juretic A,Separovic V,et al.Immunohistochemical analysis of ER,PR,HER-2,CK5/6,P63 and EGFR antigen expression in Medullary breast cancer〔J〕.Tu-mori,2008,94(6):838.

[5] Gross ME,Shazer RI,Agus DB.Targeting the HER-kinase axis in cancer〔J〕.Sem in Oncol,2004,31(ISupp13):9.

[6] Rmali KA,Puntis MC,Jiang WC.Tumou-associated angiogenesis in human colorectalr〔J〕.Colorectal Dis,2007,9(1):3.

[7] Huang J,Kontos CD.PTEN modulates vascular endothelial growth factorm ediated signaling and angiogenic effects〔J〕.J Biol Chem,2002,277(13):10760.

[8] 王恩華,滕 蕾,王培林.PTEN基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)〔J〕.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007,43(2):153.

[9] Casanova MI,Larcher F,Casanova B,et al.A critical role for rasmediated epidermal gnwth factor receptor-dependent angiogenesis in mouse skin carcinogenesis〔J〕.Cancer Res,2002,62(12):3402.

[10] Yang I,Kuang LG,Zheng HC,et al.PTEN encoding product a marker for tumorigenesis and progression of gastric carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol,2003,9(1):35.