中國(guó)南方不同品系福壽螺對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)易感性的研究*

曾清香,孫志堅(jiān),張 波,彭東覺(jué),曲振宇,楊 蕭,吳忠道,詹希美,何 藹

福壽螺(Pomacea canaliculata,Lamarck 1822)原產(chǎn)于南美洲,屬外來(lái)入侵物種[1],其可作為廣州管圓線蟲(chóng)(Angiostrongylus cantonensis,Chen 1935)的中間宿主引起人嗜酸性腦膜腦炎[2]。自從Nomura和 Lin[3]報(bào)道了首例人感染廣州管圓線蟲(chóng)以來(lái),至1992年已經(jīng)有大約30個(gè)國(guó)家有病例的報(bào)道[4]。而在中國(guó),在1996年之前,廣州管圓線蟲(chóng)感染的病例只有3例,而近些年來(lái),浙江、福建、北京等地先后出現(xiàn)廣州管圓線蟲(chóng)病暴發(fā),使得此數(shù)目迅速增加[5]。在幾次廣州管圓線蟲(chóng)大暴發(fā)流行中,均與福壽螺有關(guān),Prociv等[6]甚至認(rèn)為福壽螺已經(jīng)成了印度洋-太平洋區(qū)廣州管圓線蟲(chóng)病流行的首要因素。

有關(guān)福壽螺殼的變異,早在19世紀(jì)就有人注意到,由于福壽螺適應(yīng)能力強(qiáng),分布范圍廣,其攝食、繁殖、活動(dòng)的情況都可能在不同地區(qū)有不同的變化[7],因此其變異應(yīng)該會(huì)更多[8]。2000年中國(guó)就有人指出福壽螺可分為黑色福壽螺和黃色福壽螺[9],我們?cè)趯?duì)中國(guó)廣州各地福壽螺的觀察中發(fā)現(xiàn),除了上述依據(jù)殼色分類的兩類福壽螺外,還存在另外一類。依照傳統(tǒng)的命名,我們將其稱為灰色福壽螺,這是通過(guò)對(duì)福壽螺外殼和軟體部綜合觀察得出的[10]。本實(shí)驗(yàn)主要研究了三類福壽螺對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)的易感性。

1 材料與方法

三類福壽螺的外形特點(diǎn)及來(lái)源[10]外形特點(diǎn):(1)黑色福壽螺(見(jiàn)圖1a):殼為棕綠色,上有數(shù)量不等的黑色色帶,厴為深褐色,軟體部包括唇須、觸角、呼吸管、足等均為黑色;(2)黃色福壽螺(見(jiàn)圖1b):殼為棕黃色,不含色帶,厴亦為金黃色,軟體部包括唇須、觸角、呼吸管、足等均為黃白色;(3)灰色福壽螺(見(jiàn)圖1c):殼的外觀肉眼見(jiàn)與黑色福壽螺無(wú)區(qū)別,但軟體部,尤其在唇須、觸角、呼吸管、足邊緣可見(jiàn)大量黃色斑點(diǎn)。

依據(jù)以上外形特點(diǎn)采集福壽螺樣本,大部分黑色福壽螺來(lái)自中國(guó)科學(xué)院華南植物園池塘,少量來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田水渠;大部分黃色福壽螺來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田水渠,少部分來(lái)自廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所和中國(guó)華南植物園;所有灰螺均來(lái)自廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。

圖1 3類福壽螺外部形態(tài)a黑色福壽螺、b黃色福壽螺、c灰色福壽螺。上圖顯示螺殼形態(tài),下圖顯示爬行時(shí)外露軟體部形態(tài)。Fig.1 External features of three types of P.canaliculata1a,1b and 1c represented black P.canaliculata,yellow P.canaliculata and grey P.canaliculata respectively.And the upper showed the shells and the lower part showed the soft parts when they was crawling

1.2 廣州管圓線蟲(chóng)Ⅰ期幼蟲(chóng)(First stage larvae of A.cantonensis,L1)的獲得 將野外感染廣州管圓線蟲(chóng)的褐云瑪瑙螺(采自廣州大學(xué)城)去殼,軟組織剁碎后置于人工消化液(按2g胃蛋白酶、7mL濃鹽酸、1 000mL蒸餾水配制)內(nèi),于 37℃溫箱中消化90min并在解剖鏡下分離廣州管圓線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)(Third stage larvae of A.cantonensis,L3),將檢出的L3活蟲(chóng)40條灌胃感染SD大白鼠,6周后,收集新鮮鼠糞并用Baermann技術(shù)[11]分離L1。

1.3 福壽螺感染過(guò)程 預(yù)先將3類福壽螺各100只按上述消化褐云瑪瑙螺的方法消化并查找L3,結(jié)果均無(wú)廣州管圓線蟲(chóng)感染,證明實(shí)驗(yàn)用福壽螺均無(wú)野外感染。取三類福壽螺各90只,每類再隨機(jī)分為3組,每組30只。分別記為黑色福壽螺Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組;黃色福壽螺Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組;灰色福壽螺Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組。各組螺于感染前兩天停止喂食。Ⅰ組作為陰性對(duì)照組,不感染廣州管圓線蟲(chóng);Ⅱ、Ⅲ組分別為低劑量感染組和高劑量感染組,分別用每只螺500條和2000條L1的感染量感染福壽螺24 h,24 h后再使用相同劑量重復(fù)感染1次,即相當(dāng)于低劑量感染組感染量為每只螺1 000條L1,高劑量組為4 000條。

感染時(shí),將各組福壽螺置于相同規(guī)格的水盆中,加水至恰能淹沒(méi)所有福壽螺,再加入預(yù)定數(shù)量的L1(對(duì)照組加入相同體積的水),使福壽螺在含L1的水中感染24h。感染完成后,將所有螺置于有流動(dòng)水的大池中,喂以足量蔬菜。35d后,將所有螺取出,分別去殼取軟組織,將軟組織剁碎后每克螺肉加入20mL人工消化液(同上),置于37℃溫箱中消化90min。在解剖顯微鏡下查找L3,按照Hata等[12]的描述對(duì)L3進(jìn)行鑒定,并計(jì)數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)前稱取各組福壽螺重量,分別于感染前、感染后、感染后7、14、21、28和35 d觀察各組福壽螺活動(dòng)度,觀察并記錄整個(gè)過(guò)程中螺的死亡數(shù)量,稱取實(shí)驗(yàn)后各組福壽螺重量,記錄各螺感染L3數(shù),并計(jì)算感染率、感染度、蟲(chóng)密度(感染度/螺重量)。感染度為每只福壽螺感染L3的數(shù)量。

福壽螺活動(dòng)度的觀察:將福壽螺取出置于水盆中,加水至淹沒(méi)所有螺,搖晃水盆以使所有螺均退回殼內(nèi)。觀察并記錄 1min、3min、5min和10min開(kāi)始活動(dòng)的福壽螺數(shù)量,并計(jì)算活動(dòng)率(活動(dòng)螺數(shù)/總螺數(shù))。福壽螺活動(dòng)以伸出呼吸管或露出觸角或開(kāi)始爬行為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。福壽螺實(shí)驗(yàn)前后重量用t檢驗(yàn);死亡率及感染率運(yùn)用χ2檢驗(yàn);感染度及蟲(chóng)密度運(yùn)用秩和檢驗(yàn);運(yùn)用spearman相關(guān)分析,對(duì)感染L3福壽螺重量及感染度進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)前后實(shí)驗(yàn)組福壽螺重量 分別稱取了實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后各福壽螺的重量,見(jiàn)表1。運(yùn)用T檢驗(yàn)對(duì)各組福壽螺實(shí)驗(yàn)前后重量進(jìn)行兩兩比較,均無(wú)差別(P＞0.05)。說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)的30余天中,福壽螺并無(wú)生長(zhǎng)。在同一組中,灰色福壽螺均小于黑色福壽螺和黃色福壽螺(P＜0.05),在Ⅲ組中,黑色福壽螺小于黃色福壽螺(P＜0.05),而在Ⅱ組中,黑色福壽螺與黃色福壽螺重量無(wú)差異(P＞0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)前后實(shí)驗(yàn)組福壽螺重量Table 1 Comparison of snails'weights between pre-and postinfection

2.2 福壽螺活動(dòng)度的變化 福壽螺活動(dòng)率變化幅度較大,可能與外界環(huán)境如當(dāng)日溫度、天氣等不同有關(guān)。但同陰性對(duì)照組相比,可見(jiàn)感染組活動(dòng)率在感染完成后和感染后7 d明顯下降,隨后逐漸上升,尤以Ⅱ組明顯,至感染后28 d時(shí),實(shí)驗(yàn)組與Ⅰ組差別已不明顯;另外,Ⅲ組活動(dòng)率較Ⅱ組下降明顯(見(jiàn)圖2a)。相同組中,三類螺活動(dòng)率無(wú)明顯規(guī)律(見(jiàn)圖2b)。

圖2a 各組黃色福壽螺不同時(shí)間5min時(shí)活動(dòng)率圖2b Ⅲ組不同類福壽螺5min時(shí)活動(dòng)率Fig.2a Activity rate of yellow P.canaliculata at 5thminuteFig.2b Activity rate of dif ferent P.canaliculata in GroupⅢat 5thminute

表2 各組福壽螺死亡及感染情況Table 2 Infection status of different groups

2.3 死亡率 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),黑色福壽螺死亡率Ⅰ組為 6.67%(2/30)、Ⅱ組為 10%(3/30)、Ⅲ組為13.3%(4/30);黃色福壽螺死亡率Ⅰ組為26.67%(8/30)、Ⅱ組為6.67%(2/30)、Ⅲ組為10%(3/30);灰色福壽螺死亡率Ⅰ組為20%(6/30)、Ⅱ組為20%(6/30)、Ⅲ組為30%(3/30),見(jiàn)表 2。運(yùn)用 χ2檢驗(yàn),黑色福壽螺各組兩兩比較死亡率無(wú)差異(P＞0.05);黃色福壽螺Ⅰ組死亡率高于Ⅱ組和Ⅲ組(P＜0.05),Ⅱ組和Ⅲ組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);灰色福壽螺各組兩兩比較死亡率無(wú)差別(P＞0.05)。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)對(duì)相同組不同類螺死亡率進(jìn)行檢驗(yàn)得出,Ⅰ組黃色福壽螺死亡率高于Ⅰ組黑色福壽螺(P＜0.05),而與Ⅰ組灰色福壽螺比較無(wú)明顯差異(P＞0.05),Ⅰ組黑色福壽螺與灰色福壽螺比較無(wú)差別(P＞0.05);Ⅱ組中三類福壽螺死亡率兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Ⅲ組中三類螺死亡率兩兩比較亦無(wú)差異(P＞0.05)。

2.4 感染率 Ⅰ組三類螺均無(wú)感染;Ⅱ組中,黑色福壽螺、黃色福壽螺、灰色福壽螺的感染率分別為48.15%(13/27)、25%(7/28)、33.33%(8/24),兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Ⅲ組中,黑色福壽螺、黃色福壽螺、灰色福壽螺感染率分別為61.54%(16/26)、40.74%(11/27)、76.19%(16/21),灰色福壽螺感染率高于黃色福壽螺(P＜0.05),其余兩兩比較無(wú)差別(P＞0.05)。同類螺Ⅱ組與Ⅲ組比較,除灰色福壽螺Ⅲ組感染率明顯高于Ⅱ組(P＜0.01)外,其余兩類螺高劑量感染組與低劑量感染組感染率無(wú)差別(P＞0.05)。

2.5 感染度及蟲(chóng)密度 Ⅱ組和Ⅲ組3類福壽螺之間感染度及蟲(chóng)密度均無(wú)明顯差別(P＞0.05);同類螺不同組間進(jìn)行比較,黑色福壽螺和灰色福壽螺Ⅱ組和Ⅲ組間比較感染度和蟲(chóng)密度均無(wú)明顯差別(P＞0.05),黃色福壽螺Ⅱ組和Ⅲ組感染度有差別(P＜0.05),Ⅲ組高于Ⅱ組,蟲(chóng)密度無(wú)差別(P＞0.05)。福壽螺最低感染度出現(xiàn)在Ⅲ組灰色福壽螺,最高感染度出現(xiàn)在Ⅲ組黑色福壽螺(見(jiàn)表2)。將福壽螺感染廣州管圓線蟲(chóng)數(shù)量分為三個(gè)等級(jí)(見(jiàn)圖3):小于100條、100-500條和大于500條。Ⅱ組無(wú)感染大于500條螺存在,小于100條的福壽螺占多數(shù);Ⅲ組中開(kāi)始出現(xiàn)感染大于500條L3的螺,甚至超過(guò) 1 000條。

圖3a Ⅱ組3類福壽螺的感染情況圖3b Ⅲ組3類福壽螺的感染情況Fig.3a Infection status of P.canaliculata in GroupⅡ.Fig.3b Infection status of P.canaliculata in GroupⅢ.

2.6 螺重與易感性關(guān)系 對(duì)Ⅱ、Ⅲ組三類福壽螺感染廣州管圓線蟲(chóng)螺和無(wú)感染螺的重量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)無(wú)差別(P＞0.05),即福壽螺是否感染在成年螺中與其大小無(wú)關(guān)。而在感染L3的螺中,螺的重量與感染度亦無(wú)相關(guān)性。

3 討 論

在福壽螺的原發(fā)地——南美洲報(bào)道福壽螺有多種兼性和專性共生體[13-14],而無(wú)福壽螺感染廣州管圓線蟲(chóng)報(bào)道,也并未對(duì)人類健康造成威脅[15]。而在福壽螺入侵地,主要在亞洲,感染廣州管圓線蟲(chóng)的福壽螺致人患病已有多次暴發(fā)流行,給人的健康造成了嚴(yán)重威脅[5]。我們根據(jù)當(dāng)?shù)馗勐萃獠啃螒B(tài)將福壽螺分為3類,探討其對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)易感性,揭示其此生物學(xué)特點(diǎn)的不同,并為廣州管圓線蟲(chóng)病的防治提供參考。

本實(shí)驗(yàn)于春季進(jìn)行,平均氣溫超過(guò)20℃,且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中供給充足食物,無(wú)蟲(chóng)感染時(shí),福壽螺的生長(zhǎng)應(yīng)該是連續(xù)的[16],且較小的螺生長(zhǎng)更快[17]。然而在本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組福壽螺均無(wú)生長(zhǎng),說(shuō)明廣州管圓線蟲(chóng)感染可能使螺的生長(zhǎng)出現(xiàn)了停滯。實(shí)驗(yàn)組螺在感染后活動(dòng)率下降也說(shuō)明廣州管圓線蟲(chóng)的感染對(duì)福壽螺產(chǎn)生了負(fù)面影響。黑色福壽螺和灰色福壽螺實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較死亡率無(wú)差別,說(shuō)明螺的死亡并非是由于感染引起,其死亡可能與氣溫水質(zhì)、壽命等因素有關(guān)[16]。黃色福壽螺陰性對(duì)照組死亡大于實(shí)驗(yàn)組,由于黃色福壽螺的感染率及感染度均較低,可能小劑量的廣州管圓線蟲(chóng)的感染增強(qiáng)了其對(duì)外界環(huán)境的抵抗力,相關(guān)原因還需進(jìn)一步的研究。

Ⅱ組三類福壽螺感染率及感染度無(wú)差別,而在Ⅲ組中,黃色福壽螺感染率低于灰色福壽螺,三類螺感染度無(wú)差別。由于灰色福壽螺重量較黑色福壽螺和黃色福壽螺小,我們還對(duì)三類螺的蟲(chóng)密度進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)同組三類福壽螺亦無(wú)差別。本實(shí)驗(yàn)中,各感染組福壽螺感染率均較低,感染度亦不高,這與Smarn等[18]人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,在他的研究中,隨著感染劑量的增加,蟲(chóng)的回復(fù)率無(wú)升高甚至出現(xiàn)下降?？梢?jiàn),福壽螺感染廣州管圓線蟲(chóng)的個(gè)體差異較大,這種差異掩蓋了感染劑量不同帶來(lái)的影響。然而,在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組即使在未發(fā)現(xiàn)L3的福壽螺體內(nèi)亦有蟲(chóng)鞘膜存在(Ⅱ組中數(shù)量較多,Ⅲ組中數(shù)量較少),這說(shuō)明福壽螺被感染過(guò),只是蟲(chóng)由于某些未知因素的作用已死亡并被吸收,這種作用可能與福壽螺自身免疫以及蟲(chóng)之間的相互作用有關(guān)[19]。另外,通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組螺重量的分析發(fā)現(xiàn),福壽螺是否感染及感染蟲(chóng)量的多少與螺的重量大小無(wú)關(guān)。

總之,福壽螺屬外來(lái)入侵物種,不同的生存環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生不同的變異,包括外部形態(tài)的變異和某些生物學(xué)特征的變異。本文在對(duì)不同品系福壽螺對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)易感性的研究中發(fā)現(xiàn),黃色福壽螺對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)的抵抗性較強(qiáng)。這可能與黃色福壽螺在中國(guó)多個(gè)省份所占比例較黑色福壽螺多的現(xiàn)狀有關(guān)[20]。當(dāng)然,有關(guān)福壽螺其他的變異還需要更多的研究來(lái)證實(shí)。

(感謝武鴻美在福壽螺顯微結(jié)構(gòu)的描述上對(duì)我們的幫助)

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