反相高效液相色譜法測定瘤胃液中的生物胺

王東升 霍文婕 朱偉云 毛勝勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095)

生物胺(biogenic amine，BA)是脂肪族、芳香族或雜環(huán)族的低分子質(zhì)量有機(jī)堿，常存在于動(dòng)植體內(nèi)及食品中［1］。反芻動(dòng)物瘤胃液中的生物胺主要是由瘤胃液中相關(guān)微生物產(chǎn)生的酶或飼料原料中固有的酶催化瘤胃液中游離氨基酸脫羧基生成［2］。正常狀態(tài)下，瘤胃液中生物胺濃度很低，但當(dāng)動(dòng)物攝入的蛋白質(zhì)或可發(fā)酵碳水化合物大量增加時(shí)，瘤胃液中的生物胺濃度會(huì)增加，進(jìn)而致宿主出現(xiàn)一系列疾病，如蹄葉炎等［3］。因此，建立瘤胃液中生物胺的檢測方法，對于了解瘤胃內(nèi)生物胺的生成規(guī)律具有重要意義。

盡管目前已有多種方法應(yīng)用于食品生物胺的測定，如:薄層色譜(TLC)、毛細(xì)管電泳(cE)、氣相色譜(GC)以及基于生物傳感器的方法等［1，4］，但有關(guān)瘤胃液中生物胺的檢測方法的報(bào)道很少，并且多為僅針對于某一類生物胺，如組胺或色胺等。實(shí)際上，瘤胃液中還可能存在腐胺、尸胺等源于氨基酸的異常代謝產(chǎn)物，而這些物質(zhì)也會(huì)對宿主健康帶來危害［3］。由此，為進(jìn)一步了解瘤胃內(nèi)生物胺的生成規(guī)律，本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法，建立瘤胃液生物胺的測定方法，擬為深入探討瘤胃內(nèi)氨基酸的代謝及生物胺的生成規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和樣品

色胺(tryptamine，TRY)、腐 胺(putrescine，PUT)、甲胺(methylamine，MET)、組胺(histamine，HIS)、酪胺(tyramine，TYR)、丹磺酰氯(dansyl chloride)均購自Sigma公司。乙腈、乙酸銨和丙酮為色譜純;鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、冰乙酸為分析純;超純水(Milli-Q，Millipore公司)在實(shí)驗(yàn)室制備。瘤胃液采自飼喂精粗比為1∶9和7∶3的6頭長江三角洲白山羊(雄性)，飼糧精飼料由70%玉米和30%豆粕組成，粗飼料由70%苜蓿和30%羊草組成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取色胺 16.0 mg、腐胺 16.1 mg、組胺11.1 mg、酪 胺 13.7 mg、甲胺 6.75 mg，用0.5 mol/L的鹽酸定容至10 mL，制成10 mol/L儲(chǔ)備液備用。分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用0.5 mol/L鹽酸配制成終濃度分別為10、100、1 000 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用鋁箔紙避光、-25℃保存。

1.2.2 樣品處理

取 100 μL 待測樣品加入150 μL 的0.5 mol/L的鹽酸，渦旋混勻后4℃下13 000 r/min離心10 min，沉淀部分如上述方法再提取1次。取2次的上清液用0.5 mol/L的鹽酸定容到10 mL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的衍生化

分別取上述的生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液200 μL，加入 100 μL 的飽和碳酸氫鈉溶液(用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=11)進(jìn)行緩沖，再加入100 μL的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(10 g/L，丙酮為溶劑)，然后置于60℃水浴中、黑暗條件下反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL的1%冰乙酸。衍生處理后，4℃下13 000 r/min離心10 min后取上清液待測［5］。

1.2.4 儀器設(shè)備

島津液相色譜系統(tǒng)(LC-10ATVP)。

1.2.5 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流速為1 mL/min，紫外檢測器波長為 260 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為乙酸銨溶液，采用梯度洗脫，程序見表1。

1.2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取新鮮樣品，按照1.2.2方法處理樣品，取200 μL樣品加入5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，使之相當(dāng)于各添加125和250 μmol/L的濃度，3次重復(fù)試驗(yàn)，扣除樣品中空白試驗(yàn)生物胺的濃度，求得其回收率。

1.2.7 不同精粗比飼糧對山羊瘤胃液中生物胺濃度的影響

受試動(dòng)物為6頭裝有永久性瘤胃瘺管、體況良好的雄性長江三角洲白山羊，單欄飼喂，自由飲水。受試動(dòng)物隨機(jī)分為2組，分別飼喂精粗比為1∶9(日飼喂精飼料 100 g，粗飼料900 g)和 7∶3(日飼喂精飼料700 g，粗飼料300 g)的飼糧。精飼料和粗飼料組成與1.1中相同。于08:00和20:00分2次等量飼喂。

適應(yīng)飼糧 18 d后，于第 19、20、21天飼喂(08:00)前采集瘤胃液，用于初步研究2種飼糧精粗比條件下飼喂前瘤胃液中5種生物胺的差異。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedures

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平置于 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 保留時(shí)間

本試驗(yàn)采用乙腈和水為流動(dòng)相，并采用表1所示的梯度程序洗脫。在使用單標(biāo)確定保留時(shí)間(表2)的基礎(chǔ)上，將5種單標(biāo)混合，取混合的混標(biāo)進(jìn)行色譜分離，由圖1、圖2可見，5種胺在40 min內(nèi)能得到很好分離，且峰形對稱，沒有拖尾等現(xiàn)象。

表2 5種生物胺的保留時(shí)間Table 2 Retention time of the five biogenic amines

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限

將標(biāo)準(zhǔn)溶液依次以10、100和1 000 μmol/L進(jìn)樣，所得峰面積對相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。本方法的檢出限是以信噪比(S/N)大于3作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，色胺的檢測限為10.0 μmol/L，甲胺的檢測限為 1.2 μmol/L，其余3 種胺的檢測限都為 1.0 μmol/L。

圖1 生物胺混標(biāo)色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of biogenic amine

圖2 瘤胃液生物胺色譜圖Fig.2 Chromatogram of biogenic amine in rumen liquid

2.3 回收率測定

由表4可知，5種生物胺的平均回收率如下:酪胺 94.97%、腐胺 95.54%、組胺 93.48%、甲胺92.90%、色胺 93.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10%，可見該方法可滿足檢測的需要。

2.4 飼糧精粗比對瘤胃液5種生物胺的影響

由表5可見，在2種飼糧精粗比條件下，高精料瘤胃液中酪胺與甲胺濃度均顯著高于低精料組(P＜0.05)，但二者間在腐胺、組胺及色胺濃度上無顯著性差異(P＞0.05)。

表3 生物胺的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 3 Regression equation，correlation coefficient square and the detectability of biogenic amine

表4 本試驗(yàn)方法的回收率Table 4 Average recovery of the method in the present study

表5 飼糧精粗比對瘤胃液中5種生物胺濃度的影響Table 5 Effects of dietary forage-to-concentrate ratio on concentrations of the five biogenic amines in rumen liquid μmol/L

3 討論

生物胺是一類含氮低分子化合物，對動(dòng)植物和微生物有重要的生理作用。適量的生物胺有助于動(dòng)物機(jī)體正常的生理功能，過量則會(huì)引起不良生理反應(yīng)。目前國內(nèi)外有關(guān)瘤胃內(nèi)生物胺的檢測主要采用液相色譜法，一般僅針對組胺［6］。實(shí)際上瘤胃中還含有其他的生物胺(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、尸胺、甲胺等)，且其存在會(huì)對組胺的毒性有協(xié)同作用［3，8-9］。因此，多組分生物胺的同時(shí)檢測對于了解瘤胃微生物對氨基酸的代謝以及研究瘤胃健康具有重要生物學(xué)意義。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用丹磺酰氯柱前衍生方法，應(yīng)用紫外檢測器能夠滿足分析檢測瘤胃液中生物胺的需求，瘤胃液中色胺、腐胺、甲胺、組胺、酪胺5種生物胺能在40 min內(nèi)得到很好分離。除了酪胺外，其他生物胺的線性范圍為10～1 000 μmol/L(R2＞0.99)，該方法的平均回收率分別為色胺 93.00%、腐 胺 95.54%、甲 胺92.90%、組胺 93.48%、酪胺 94.47%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。結(jié)果說明采用該方法可用于分析瘤胃液中的生物胺，同時(shí)分離效果好，完全滿足瘤胃液中生物胺的檢測需要。

由于我國粗飼料資源相對有限，而生產(chǎn)者過度追求經(jīng)濟(jì)效益，在奶牛生產(chǎn)中使用了大量的精飼料，雖其結(jié)果會(huì)提高奶牛的產(chǎn)奶性能，但奶牛的消化代謝疾病明顯增多，使用壽命大大縮短，給畜牧生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失［10］。相關(guān)報(bào)道表明，奶牛飼糧中精飼料比例過高時(shí)，奶牛瘤胃內(nèi)常發(fā)生急性酸中毒，瘤胃內(nèi)乳酸累積，進(jìn)而引起酸中毒而死亡，而在慢性酸中毒情況下，瘤胃內(nèi)異常代謝產(chǎn)物如組胺和內(nèi)毒素等均會(huì)大量增加，使奶牛繼發(fā)其他疾?。?1-13］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高精料飼糧條件下，山羊瘤胃液中酪胺和甲胺濃度遠(yuǎn)高于低精料飼糧，提示飼糧精粗比對瘤胃內(nèi)生物胺的濃度具有較明顯的影響。但本試驗(yàn)中，筆者未發(fā)現(xiàn)飼糧精粗比對瘤胃液中組胺、色胺和腐胺濃度的影響，可能與采樣的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)系，本試驗(yàn)僅初步研究了飼喂前瘤胃液中5種生物胺的差異，而飼喂后瘤胃內(nèi)5種生物胺是如何變化的?飼糧精粗比對這5種生物胺濃度有何影響?目前尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)建立了反相高效液相色譜法測定瘤胃液中的5種生物胺的方法。

②飼糧精粗比可影響瘤胃液中生物胺濃度，高精料飼糧條件下瘤胃液中酪胺和甲胺濃度顯著增加。

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