穿通支原體感染對(duì)成人原發(fā)性IgA腎病患者外周血T細(xì)胞亞群的影響

史艷玲 許菲菲 章建娜

穿通支原體(Mycoplasma penetrans，Mpe)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的致病性支原體，因在HIV感染及AIDS的發(fā)病進(jìn)程中起輔助作用，被稱為艾滋病相關(guān)支原體［1，2］。在其他疾病如抗磷脂抗體綜合征、非淋菌性尿道炎、腫瘤等患者的血液和/(或)分泌物中也逐漸檢到Mpe。IgA腎病是目前國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的慢性腎小球腎炎，在中國(guó)、日本、新加坡等亞太地區(qū)，約占原發(fā)性腎小球疾病的45% ～50%。在發(fā)病20年后，約20%～30%的IgA腎病緩慢進(jìn)展至慢性腎功能不全，并最終發(fā)展為終末期腎?。?］。因此，探討IgA腎病的發(fā)病及進(jìn)展因素有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者血液和尿液中Mpe感染率明顯增高［4］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)IgA腎病患者外周血 CD4+、CD8+、CD3+細(xì)胞的水平，比較 IgA腎病患者M(jìn)pe感染組和非Mpe感染組各細(xì)胞的水平，探討Mpe感染對(duì)IgA腎病患者T細(xì)胞亞群的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究分兩組IgA腎病組、正常對(duì)照組，IgA腎病組根據(jù)有無(wú)Mpe感染又分為Mpe感染組19例和非Mpe感染組83例(除外同時(shí)有其他支原體感染16例)。IgA腎病組:選取2009年1月至2010年6月期間，在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢確診的原發(fā)性IgA腎病患者，共118例，年齡＞18歲，除外繼發(fā)性疾病所致IgA腎病;選取同期在本院體檢者86例為正常對(duì)照組(除外支原體感染)。兩組患者還需滿足以下標(biāo)準(zhǔn):①近7 d內(nèi)未應(yīng)用抗菌藥。②近1年內(nèi)未接受免疫抑制治療;或接受免疫抑制治療，但療程不足1個(gè)月。

1.2 血液標(biāo)本的留取和處理 取研究對(duì)象清晨空腹靜脈血2 ml，肝素抗凝，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定 CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞，試劑盒為BD MultitestTMIMK Kit，購(gòu)自美國(guó)BD公司。流式細(xì)胞儀為FACSCalibur，購(gòu)于BD公司。流式細(xì)胞術(shù)由本院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所檢測(cè)。用促凝管采集清晨空腹靜脈血4 ml，4000rpm離心15 min，分離血清2 ml，12000rpm 離心15 min，棄上清，沉淀用于提取支原體DNA。

1.3 Mpe及支原體檢測(cè)

1.3.1 Mpe培養(yǎng) 采用改良SP-4培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.2 ml的菌株接種于1.8 ml培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)。支原體培養(yǎng)成功后，抽取2 ml菌液用于支原體DNA提取，采用全式金基因組提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 支原體檢測(cè) 用支原體種屬通用的16s rRNA基因擴(kuò)增支原體Genus片段，陽(yáng)性提示支原體感染，陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)用Mpe P35脂蛋白基因擴(kuò)增Mpe目的片段(引物序列見(jiàn)表1)，操作按PCR試劑盒(TOYOBO公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Southern blot法進(jìn)一步證實(shí)Mpe感染。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 IgA腎病組:118例患者，男64例，女54例，男女比:1.2∶1，平均年齡(40.84±6.35)歲。正常對(duì)照組:86例，男45例，女41例，男女比:1.05∶1，平均年齡為(40.65±6.98)歲。兩組之間比較:性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 穿通支原體檢測(cè)結(jié)果與試驗(yàn)分組 正常對(duì)照組，86例Genus和Mpe P35均陰性。IgA腎病組:35例Genus陽(yáng)性(陽(yáng)性率29.6%)，19例Mpe P35陽(yáng)性(陽(yáng)性率16%)。

根據(jù)Genus和Mpe P35檢測(cè)結(jié)果，將IgA腎病組分為Mpe感染組和非Mpe感染組，Mpe感染組納入Mpe P35陽(yáng)性19例。非Mpe感染組納入Mpe和Genus均陰性83例。

2.3 IgA腎病患者T細(xì)胞亞群的變化 IgA腎病組患者外周血中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而CD4+/CD8+比值較正常對(duì)照組明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 支原體PCR檢測(cè)引物

表2 IgA腎病患者T細(xì)胞亞群的變化

2.4 Mpe感染對(duì)IgA腎病患者T細(xì)胞亞群的影響 Mpe感染組和非Mpe感染組患者外周血中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞水平較正常對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而CD4+/CD8+比值較正常對(duì)照組減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與非Mpe感染組相比Mpe感染組患者外周血CD3+、CD4+細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩組間CD8+細(xì)胞水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 穿通支原體感染對(duì)IgA腎病患者T細(xì)胞亞群的影響

3 討論

目前已知Mpe可增強(qiáng)HIV的致病性，加速艾滋病進(jìn)程。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Mpe也參與了如腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移等多種疾病過(guò)程［5，6］。研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者血液和尿液中Mpe檢出明顯高于正常人群，提示Mpe感染可能參與了IgA腎病的發(fā)病。Mpe感染是通過(guò)何種機(jī)制參與IgA腎病的過(guò)程，尚不明確。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè) IgA腎病患者外周血CD4+、CD8+、CD3+細(xì)胞的水平，并比較Mpe感染組和非 Mpe感染組各細(xì)胞的水平，探討Mpe感染對(duì)IgA腎病患者T細(xì)胞亞群的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者與正常對(duì)照組相比，CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞水平明顯升高，CD4+/CD8+比例減低，Mpe感染后，IgA腎病患者外周血中CD3+、CD4+細(xì)胞升高程度有所緩解，CD4+/CD8+比值進(jìn)一步降低。

目前認(rèn)為IgA腎病是一種免疫復(fù)合物病，已知Th細(xì)胞亞群失調(diào)參與了IgA腎病的發(fā)病。主要表現(xiàn)為T(mén)h2功能亢進(jìn)及其細(xì)胞因子(IL24與IL25)生成增多、Th1細(xì)胞因子(IFN2 g與IL22)相對(duì)不足使IgA分泌IgA增加，且致IgA糖基化異常，從而參與了IgA腎病的發(fā)生發(fā)展［7］。本研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病組患者外周血中CD4+、CD8+、CD3+細(xì)胞的水平較正常對(duì)照明顯升高，提示IgA腎病不但存在Th細(xì)胞亞群失調(diào)，還存在者其他淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)。沈穎等也采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了IgA腎病患者外周血中CD3+、CD4+和CD8+的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常人相比，CD3無(wú)明顯變化，CD4明顯降低，CD8升高，CD4+/CD8+比值顯著減?。?］。雖然 CD3+和 CD4+細(xì)胞比例與我們的結(jié)果不一致，但是CD4/CD8比值與我們的研究結(jié)果一致。因此，CD4+和CD8+細(xì)胞亞群失調(diào)參與了IgA腎病的病程。

本研究發(fā)現(xiàn)Mpe感染組較非感染Mpe組CD3+和CD4+細(xì)胞比例的升高有所緩解，Mpe感染后IgA腎病這種T細(xì)胞亞群失調(diào)反而有輕微改善。本研究結(jié)果恰好可以解釋我們?cè)瓉?lái)的研究發(fā)現(xiàn)的:Mpe感染組較非Mpe感染組IgA腎病患者臨床表現(xiàn)輕，多表現(xiàn)為發(fā)作性肉眼血尿，且病理嚴(yán)重程度分級(jí)較輕。目前無(wú)Mpe感染機(jī)體后機(jī)體T細(xì)胞亞群的改變的研究，但有研究觀察到其他支原體感染如肺炎支原體后T細(xì)胞亞群失調(diào)，且多表現(xiàn)為CD3+和CD4+細(xì)胞比例減低，支持了本研究結(jié)果。

Mpe和其他致病性支原體類似，具有特殊的尖端結(jié)構(gòu)，能吸附并穿入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)增殖、形成空泡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Mpe可黏附和入侵RBC、CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，活化NF-κB，促進(jìn) TNF-α、IL-1、IL-6 等炎癥因子釋放，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。這可能部分解釋本研究中Mpe感染的IgA腎病患者外周血中CD4+細(xì)胞水平減低。

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