小鼠腹水型肝癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株DARS2蛋白表達(dá)的差異

吳學(xué)標(biāo)，胡 軍，宋 陽，宮琳琳

(大連醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

DARS2蛋白，即線粒體天冬氨酰-tRNA 合成酶2(AspRS2)是Scheper GC 等2007年確定的，與腦干脊髓白質(zhì)病變及乳糖增高癥相關(guān)[1]，與腫瘤的相關(guān)性尚未見報道。本實驗研究DARS2蛋白在具有高、低淋巴道轉(zhuǎn)移潛能的小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株Hca-F、Hca-P中的表達(dá)差異，以期發(fā)現(xiàn)新的肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗對象：具有高、低淋巴道轉(zhuǎn)移潛能的小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株Hca-F、Hca-P，由大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室篩選提供，本實驗室長期凍存。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibcobrl公司)，ECL試劑盒(Amersham Biosciences公司)，PVDF膜(Pall公司)，兔抗小鼠DARS2多克隆抗體(Protein Tech Group公司)，羊抗兔IgG(Santa公司)，免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇凍存的細(xì)胞，分別將Hca-F，Hca-P細(xì)胞接種615小鼠腹腔，7 d無菌條件下抽取腹水，以PBS緩沖液洗滌1次，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%的胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基中(含青霉素100 μg/mL，鏈霉素100 μg/mL)，在37 ℃、飽和濕度及5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使巨噬細(xì)胞貼壁，收集未貼壁細(xì)胞即Hca-F細(xì)胞、Hca-P細(xì)胞備用。

1.2.2 免疫印跡分析：分別提取Hca-F細(xì)胞及Hca-P細(xì)胞的總蛋白；取上清液倍比稀釋，用考馬斯亮藍(lán)染色，于波長595 nm處測吸光度。分別將相同含量的蛋白樣品和上樣緩沖液以體積比1∶1的比例混合，水中煮沸5 min，使蛋白質(zhì)變性，以每孔30 μg的蛋白含量點樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，分別加DARS2一抗(1∶500)室溫?fù)u床孵育3 h，用TBS緩沖液洗4次，10 min/次，加入二抗(1∶1000)室溫?fù)u床孵育2 h，再用TBS緩沖液洗滌3次，10 min/次。加入發(fā)光試劑(ECL)顯色。以β-actin作內(nèi)參照。用圖像分析軟件計算出每個蛋白條帶的積分光密度；計算出目的條帶積分光密度/對應(yīng)內(nèi)參條帶積分光密度的比值，該值即可反映對應(yīng)樣品內(nèi)目的蛋白的相對含量。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)實驗：分別離心收集Hca-F細(xì)胞及Hca-P細(xì)胞，制成細(xì)胞涂片，入80 ℃烘箱中烤片3 h；純丙酮固定20 min；0.1%Tritou X-100孵育30 min；H2O2孵育15 min；正常動物血清封閉10 min；滴加一抗，濕盒中4 ℃孵育過夜；PBS洗3次；滴加二抗，室溫孵育20 min。以上各步驟間均以PBS洗3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。陽性表達(dá)可見棕黃色沉淀物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗結(jié)果均來自至少3組平行或3次重復(fù)實驗。數(shù)據(jù)由SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。本實驗所涉及的兩組實驗數(shù)據(jù)比較采用t檢驗分析，數(shù)值用 mean±SD 表示，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2. 1 免疫印跡分析細(xì)胞中DARS2蛋白的表達(dá)

經(jīng)免疫印跡分析檢測DARS2蛋白的表達(dá)情況。通過圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，與β-actin內(nèi)參照相比，DARS2蛋白的相對含量在小鼠腹水型肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-F中的表達(dá)中僅為0.219±0.016，明顯低于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-P 細(xì)胞的0.473±0.043(圖1)。差異有顯著性意義(P=0.01)。

圖1 免疫印跡分析DARS2蛋白表達(dá)

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞中DARS2蛋白的表達(dá)

經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)一步檢測DARS2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示DARS2蛋白在小鼠腹水型肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-F及低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-P 細(xì)胞中均有表達(dá)，但在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-F細(xì)胞中表達(dá)較少；在低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-P細(xì)胞中表達(dá)較多，表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，顯示較強(qiáng)的棕黃色沉淀物(圖2)。結(jié)果與免疫印跡分析一致，進(jìn)一步證實了DARS2蛋白在小鼠腹水型肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-F中的表達(dá)明顯低于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-P 細(xì)胞。

3 討 論

線粒體是細(xì)胞能量代謝中心。若線粒體受到損傷，則會影響整個細(xì)胞的正常功能。近年，線粒體與腫瘤之間的聯(lián)系已引起了專家學(xué)者的普遍關(guān)注。國內(nèi)外已在乳腺、肺、胃、肝、胰、結(jié)腸、腎、膀胱、前列腺、甲狀腺和卵巢等處的惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了線粒體DNA突變。

最近的研究結(jié)果表明，線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)翻譯機(jī)器的組成成分——氨基酰-tRNA 合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase，AARS)與人類的疾病密切相關(guān)。AARS是一類古老的蛋白質(zhì)家族，能催化tRNA 的氨基?；磻?yīng)，生成氨基酰，為蛋白質(zhì)生物合成提供原料[2]。目前，已有研究表明人線粒體天冬氨酰-tRNA 合成酶(AspRS)基因上的一系列突變可導(dǎo)致其 mRNA 被快速降解或者蛋白質(zhì)氨基酸一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起腦干脊髓白質(zhì)病變及乳糖增高癥。研究者首先根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了來自30 個家庭的38 個患者的遺傳圖譜，在1 號染色體的一段特定區(qū)域發(fā)現(xiàn)了潛在的致病基因。對這一區(qū)域進(jìn)行DNA 測序，發(fā)現(xiàn)了致病基因DARS2。DARS2位于染色體1q25.1，廣泛存在于睪丸、腦、未知功能組織、胚胎組織、胰臟、眼睛、腎臟、胎盤、前列腺、脾臟、肌肉、皮膚、肝、乳腺、子宮、卵巢、脂肪組織、淋巴結(jié)、膀胱、垂體、口、氣管、胃、腸、咽喉、肺、結(jié)締組織、唾液腺、腹水、胸腺、血管、神經(jīng)、骨、骨髓、心臟等組織。該基因編碼線粒體AspRS，負(fù)責(zé)線粒體基因組遺傳密碼的解析。在這些患者的DARS2 中發(fā)現(xiàn)了一系列不同的點突變，包括無義突變、錯義突變和內(nèi)含子序列突變。但是，健康個體的對照組(400～420個)的DARS2 中卻沒有任何突變，證實了DARS2基因的致病性[1-2]。隨后，有研究者相繼在DARS2中發(fā)現(xiàn)新的點突變，并證實DARS2基因突變可以作為腦干脊髓白質(zhì)病變的診斷指標(biāo)之一[3-7]。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測DARS2蛋白的表達(dá) ×400

本研究以小鼠腹水型肝癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-F和Hca-P為細(xì)胞模型，探討DARS2蛋白在這一對細(xì)胞株中的表達(dá)是否具有差異性。本實驗采用的動物模型為615型小鼠，因為在一般的小鼠中腹水型肝癌細(xì)胞并不能很好地增殖表達(dá)。Hca-F和Hca-P細(xì)胞是由腹水型肝癌細(xì)胞H22中篩選出的特異性淋巴道轉(zhuǎn)移的高低轉(zhuǎn)移株。其中，Hca-F細(xì)胞為高轉(zhuǎn)移株，Hca-P細(xì)胞為低轉(zhuǎn)移株，兩株細(xì)胞具有高度的同源性，是研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理的較好模型。本實驗免疫印跡分析及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測結(jié)果均顯示DARS2蛋白在腹水型肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-F中的表達(dá)明顯低于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-P細(xì)胞；表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)果提示，DARS2蛋白的表達(dá)降低可能與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。DARS2可能由于發(fā)生了點突變而使DARS2蛋白的表達(dá)降低，進(jìn)而使線粒體受到損傷，影響了細(xì)胞的生物學(xué)功能，提高了細(xì)胞的侵襲、遷移能力。DARS2與腫瘤的相關(guān)性目前尚未見報道，還有待于進(jìn)一步的實驗研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Scheper GC, van der Klok T, van Andel R J, et al. Mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase deficiency causes leukoencephalopathy with brain sten and spinal cord involvement and lactate elevation[J]. Nat Genet, 2007, 39(4):534-539.

[2] 周小龍, 王恩多.與人類疾病相關(guān)的幾種線粒體氨基酰-tRNA合成酶. 生物化學(xué)與細(xì)胞物理學(xué)進(jìn)展[J]. 2008, 35(8):853-858.

[3] Uluc K, Baskan O, Yildirim KA, et al. Leukoencephalopathy with brain stem and spinal cord involvement and high lactate: a genetically proven case with distinct MRI findings[J]. J Neurol Sci, 2008, 273(1-2):118-122.

[4] Sharma S, Sankhyan N, Kumar A, et al. Leukoencephalopathy with brain stem and spinal cord involvement and high lactate: a genetically proven case without elevated white matter lactate[J]. J Child Neurol, 2011, 26(6):773-776.

[5] Orcesi S, La Piana R, Uggetti C, et al. Spinal cord calcification in an arly-onset progressive leukoencephalopathy[J]. J Child Neurol, 2011, 26(7):876-880.

[6] Lin J, Chiconelli Faria E, Da Rocha AJ,et al. Leukoencephalopathy with brainstem and spinal cord involvement and normal lactate: a new mutation in the DARS2 gene[J]. J Child Neurol, 2010, 25(11):1425-1428.

[7] Isohanni P, Linnankivi T, Buzkova J, et al. DARS2 mutations in mitochondrial leucoencephalopathy and multiple sclerosis[J]. J Med Genet, 2010, 47(1):66-70.