鴨肝炎病毒GD－B株生物學(xué)特性測定＊及多聚蛋白基因序列分析

黃良宗，劉鰻儀，王淑敏，司興奎，顧萬軍＊

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，廣東佛山 528231；2.佛山市南山動物防疫站，廣東佛山 528000）

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的雛鴨的一種急性、高度接觸性傳染病［1］。Sandhu T S等［2］發(fā)現(xiàn)了Ⅰ 型鴨肝炎病毒變異株，稱為Ⅰa型鴨肝炎病毒。用雞胚做交叉中和試驗，證實Ⅰ 型和Ⅰa型毒株之間有部分交叉反應(yīng)，但結(jié)果有些反復(fù)。國內(nèi)許多地區(qū)頻頻出現(xiàn)免疫鴨群暴發(fā)鴨病毒性肝炎的報道［3－6］。陳建 紅 等［7］發(fā) 現(xiàn) 珠 江 三 角 洲 地 區(qū) 部 分DHV可能由于長期的自然傳播，其毒力增強，若這些毒力增強的變異株伴隨著抗原的變異，則易造成免疫失敗。本研究測定了廣東分離的DHV野毒株GD－B株多聚蛋白基因序列和病毒的部分生物學(xué)特性，對開展鴨肝炎病毒分子流行病學(xué)監(jiān)測和免疫防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 鴨肝炎病毒GD－B株，2007年分離自廣東新興發(fā)病鴨群，廣東溫氏食品集團有限公司溫納相博士提供；鴨肝炎病毒SN株，2000年分離自廣東三水發(fā)病鴨群，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究室保存。DHV－Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)毒株購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試驗用動物 9日齡雞胚購自南海獅山種雞場；7日齡健康雛鴨購自本?？蒲星輬觥?/p>

1.2 方法

1.2.1 兔抗Ⅰ型DHV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及分離株高免血清制備 兔抗DHV血清，包括標(biāo)準(zhǔn)DHV－Ⅰ血清，DHV－SN血清和 DHV－B血清，依次由 DHV－Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)毒株、DHV－SN和DHV－B病毒液制備成蜂膠佐劑滅活疫苗，按常規(guī)免疫家兔制成，無菌檢驗合格后置－20℃冰箱保存?zhèn)溆茫煌醚?，由健康家兔采血制備，無菌檢驗合格后置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CELD50測定 取標(biāo)準(zhǔn)毒株和GD－B株病毒雞胚尿囊液分別進行l(wèi)0－1～l0－9稀釋，每個稀釋度接種5枚9日齡雞胚，0.2mL／枚，并設(shè)空白對照，按Reed－Muench法計算CELD50，試驗重復(fù)一次，取兩次平均值。

1.2.3 對7日齡雛鴨的致病性與半數(shù)致死量（LD50）的測定 分別將各野毒株用滅菌生理鹽水作原液至10－5稀釋，每株病毒每個稀釋度接種7日齡雛鴨7只，0.3mL／只，試驗同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)DHV對照組和正常雛鴨對照組，然后隔離飼養(yǎng)觀察。按常規(guī)計算GD－B株對7日齡雛鴨的LD50，解剖死亡鴨觀察病理變化，抽檢病死雛鴨的細(xì)菌感染情況及病毒分離情況。

1.2.4 中和試驗 采用固定病毒稀釋血清法分別測定標(biāo)準(zhǔn)鴨肝炎病毒血清對GD－B株和SN株中和指數(shù)。置兔抗鴨肝炎病毒血清于56℃水浴滅能30 min，然后用滅菌生理鹽水稀釋病毒液至濃度200 ELD50／0.2mL，將病毒液分別與等體積1∶2、1∶8、1∶32、1∶128、1∶512稀釋的血清混合，37℃作用60min，每個稀釋度接種5枚9日齡的雞胚，0.2 mL／枚。同時設(shè)陽性對照和空白對照。按常規(guī)方法計算抗體中和指數(shù)以及毒株間的相關(guān)系數(shù)。判定標(biāo)準(zhǔn)：中和指數(shù)大于50判定為陽性，10～49為可疑，小于10為陰性。

1.2.5 多聚蛋白基因序列測定 根據(jù)GenBank上收錄的Ⅰ型鴨肝炎病毒的多聚蛋白基因組序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計8對特異性引物，使每個相鄰片段部分重疊，第1～5片段大小均為1 000bp，第6～8片段大小分別為930、760、476bp。按常規(guī)方法提取病毒RNA，RT－PCR方法分段擴增多聚蛋白基因序列，并克隆到pMD18－T載體中。將重組菌送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。應(yīng)用分子生物學(xué)軟件DNA Star分析DHV GD－B株多聚蛋白基因序列進行拼接及比對，與國內(nèi)外發(fā)表的參考毒株序列進行比較并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 CELD50測定結(jié)果

按Reed－Muench法計算出GD－B株的CELD50為10－4.68。

2.2 對7日齡雛鴨的致病性與半數(shù)致死量（LD50）的測定

雛鴨攻毒后36h后開始發(fā)病死亡，死亡主要集中在72h～96h；臨床癥狀為精神萎靡，食欲廢絕，呈現(xiàn)角弓反張狀，同時伴有高聲鳴叫。剖檢死亡鴨，病變特征與自然發(fā)病病例相似，表現(xiàn)為肝臟腫脹，呈土黃色，有明顯的出血斑點，膽囊多數(shù)呈草青色或茶色；腎腫脹、淤血、出血；肺淤血?？蓮陌l(fā)病鴨的肝臟重新分離到接種的病毒，而未分離到細(xì)菌。對照鴨全部健康存活。GD－B株和標(biāo)準(zhǔn)DHV LD50分別為10－4.13／0.3mL和10－4.08／0.3mL。

2.3 中和試驗結(jié)果

病毒對照組全部死亡，空白對照組正常。根據(jù)Reed－Muench法計算得出標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對GD－B株的中和指數(shù)為23.3（10～49），對SN株中和指數(shù)為50。

2.4 多聚蛋白基因序列分析

分8個片段成功擴增到預(yù)期大小的多聚蛋白基因片段，如圖1。序列比對結(jié)果表明GD－B株多聚蛋白基因與廣東DHV－Ⅰ型GFS99株的同源性最高，達(dá)99.4%～99.5%，與臺灣變異株90D的同源性最低，只有72.6%～72.7%，因此可以推斷 GD－B株屬于DHV－Ⅰ型。根據(jù)核苷酸序列繪制的系統(tǒng)進化樹形成明顯的三個大群，分別為DHV－Ⅰ型毒株、韓國和中國大陸的變異株、中國臺灣變異株（圖2）。

圖1 多聚蛋白基因序列分段RT－PCR擴增Fig.1 RT－PCR amplification of polyprotein gene sequence

圖2 多聚蛋白核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of polyprotein nucleotid sequenc

3 討論

GD－B株與弱毒疫苗株多聚蛋白核苷酸序列同源性為99.5%，與參考毒株同源性為72.6%～99.5%，與臺灣變異株90D的同源性最低，只有72.6%～72.7%，推斷該毒株屬于DHV－Ⅰ型。多聚蛋白基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹形成明顯的3個分支，分別為DHV－Ⅰ型毒株分支、韓國和中國大陸的變異株分支、中國臺灣變異株分支。根據(jù)多聚蛋白基因序列構(gòu)建的遺傳進化樹各分支的研究發(fā)現(xiàn)，一方面，GD－B株與弱毒疫苗株和SN株的親緣關(guān)系最近，而本實驗室對SN株的毒力測定結(jié)果為強毒株［8］；另一方面，強毒03D株與弱毒A66株，JX株，C80株處于一個較小的分支上。以上結(jié)果提示通過整個編碼區(qū)來判定毒株毒力強弱存在一定的局限性。因此，目前對毒株毒力的判定主要還需要依賴于生物學(xué)特性的相關(guān)試驗。從動物試驗和多聚蛋白基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)GD－B株與SN株均是Ⅰ型鴨肝炎病毒強毒株，但從中和試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與標(biāo)準(zhǔn)I型DHV之間的抗原性發(fā)生變異。病毒中和試驗表明，標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型DHV陽性血清對分離株SN病毒的中和指數(shù)為50，結(jié)果為陽性，說明DHV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對SN株病毒有中和能力，進一步證明SN株為Ⅰ型鴨肝炎病毒株；標(biāo)準(zhǔn)DHVⅠ陽性血清對GD－B株的中和指數(shù)為23.3，處于可疑范圍。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)分離到與Ⅰ型鴨肝炎病毒具有相同基因組結(jié)構(gòu)，但不同血清型的新型DHV，且國內(nèi)新型DHV與“中國臺灣新型”和“韓國新型”DHV核苷酸相似性較低，尚不清楚“中國臺灣新型”和“韓國新型”DHV之間是否存在血清學(xué)相關(guān)性，故學(xué)者建議對DHV的血清型重新命名為“血清Ⅰ型”、“中國臺灣新型”、“韓國新型”DHV，將基因型分為A型（DHV A），B型（DHV B）和C型（DHV C）3個不同的基因型［9］。何冉婭等［10］報道，2007年－2009年采集華南地區(qū)發(fā)病鴨場病鴨分離檢測到15株新型DHV（基因型為C型），3株Ⅰ型DHV（基因型為A型），表明華南地區(qū)有DHV－A和DHV－C型。為了快速準(zhǔn)確地診斷與防控本病，必須盡快建立型變異株或不同血清型毒株的實驗室檢測手段，加強其分子流行病學(xué)調(diào)查。

［1］卡爾尼克B W.禽病學(xué)［M］.10版.高 福，蘇敬良，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

［2］Sandhu T S，Calnek B W，Zeman L.Pathologic and serologic characterization of a variant of duck hepatitis type I virus［J］.Avian Dis，1992，36：932－936.

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［4］Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1reveals a novel lineage close to the genus parechovirus in the family picornaviridae［J］.J Gen Virol，2006，87：3307－3316.

［5］鄭獻進，張大丙，曲豐發(fā)，等.Ⅰ型鴨肝炎病毒變異株的鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，42（5）：15－16.

［6］陳曉丹，張 云，王 鈺，等.I型鴨肝炎病毒株和株全基因組序列分析［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2009，39（12）：1057－1061.

［7］陳建紅，張濟培，司興奎，等.標(biāo)準(zhǔn)鴨肝炎Ⅰ型血清對鴨肝炎野毒株的免疫保護試驗［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2001，21（3）：231－235.

［8］陳建紅，張濟培，司興奎，等.珠江三角洲地區(qū)鴨肝炎病原分離及其致病性和理化特性測定［J］.中國獸醫(yī)科技，2001，31（4）：3－6.

［9］Fu Y，Pan M，Wang X，et al.Molecular detection and typing of duck hepatitis A virus directly from clinical specimens［J］.Vet Microbiol，2008，131：247－257.

［10］何冉婭，于 森，張玉玲，等.2007－2009年華南地區(qū)鴨肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查及分離株的VP1基因變異分析［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2010，18（1）：7－15.