白楊細(xì)胞質(zhì)遺傳的細(xì)胞學(xué)機(jī)理(Ⅱ)1)——質(zhì)體和線粒體在生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中的分布與變化

崔彬彬 楊妮娜 孫宇涵 徐兆翮

(林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

陳 萍

(保定學(xué)院)

馮 慧

(北京市園林科學(xué)研究所)

李 云

(北京林業(yè)大學(xué))

細(xì)胞質(zhì)遺傳在植物中是指質(zhì)體和線粒體的遺傳。早在1909年Correns和Baur分別在紫茉莉(Mirabilis jalapa)和馬蹄紋天竺葵(Pelargonium zonale)中就發(fā)現(xiàn)了質(zhì)體的母系遺傳和雙親遺傳現(xiàn)象。此后，很多學(xué)者發(fā)表了大量的有關(guān)被子植物和裸子植物細(xì)胞質(zhì)遺傳的研究結(jié)果［1－6］。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)楊樹(shù)細(xì)胞質(zhì)遺傳的報(bào)道主要以黑楊派(Section Aigeiros)、青楊派為主(Section Tacamahaca)，他們只是用單一的方法對(duì)楊屬進(jìn)行了部分研究［7－11］，對(duì)楊樹(shù)尤其是白楊派(Section Leuce)細(xì)胞質(zhì)遺傳方式及其機(jī)理并沒(méi)有很全面、系統(tǒng)的研究。

自2004年起，崔彬彬、李云等［12－14］對(duì)白楊派樹(shù)種及其三倍體雜種細(xì)胞質(zhì)遺傳進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。以白楊派毛白楊(Poplus tomentosa)、銀白楊(P.alba)、中國(guó)山楊(P.davidiana)、響葉楊(P.adenopoda)、新疆楊(P.bolleana)、毛新楊(P.tomentosa×P.bolleana)、銀腺楊(P.alba×P.glandulosa)、銀毛楊(P.alba×P.tomentosa)8個(gè)種及其三倍體雜種為材料，通過(guò)不同發(fā)育時(shí)期花粉細(xì)胞學(xué)觀察、成熟花粉核酸酶檢測(cè)、PCR－RFLP分子標(biāo)記技術(shù)，圍繞質(zhì)體和線粒體及其DNA在花粉發(fā)育過(guò)程中的存在狀況、變化規(guī)律與遺傳機(jī)理進(jìn)行了研究。同時(shí)，對(duì)不同親本來(lái)源的三倍體毛白楊雜種葉綠體性狀變異進(jìn)行了分析，檢測(cè)是否有細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)發(fā)生，取得一定的進(jìn)展。本研究主要涉及花粉發(fā)育中質(zhì)體和線粒體在生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的分布與變化，是白楊細(xì)胞質(zhì)遺傳的細(xì)胞學(xué)機(jī)理研究工作的報(bào)道之二。

近年來(lái)，由于試驗(yàn)手段的不斷改進(jìn)，細(xì)胞質(zhì)遺傳的檢測(cè)方法由早期的正反交試驗(yàn)等經(jīng)典遺傳學(xué)方法到現(xiàn)代的電子顯微鏡技術(shù)、分子生物學(xué)等技術(shù)的綜合應(yīng)用［6，11，15－16］。遺傳學(xué)試驗(yàn)和分子標(biāo)記技術(shù)使人們對(duì)植物細(xì)胞質(zhì)遺傳方式有了廣泛的認(rèn)識(shí)，而細(xì)胞學(xué)方法能對(duì)不同類型細(xì)胞質(zhì)遺傳方式的機(jī)理做出更確切的解釋，使細(xì)胞質(zhì)遺傳機(jī)理的研究得以迅速深入［16－19］。迄今為止，許多研究者通過(guò)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察，確定質(zhì)體和線粒體是否在生殖細(xì)胞和精細(xì)胞中存在，以及是否經(jīng)過(guò)受精作用傳遞到合子中。從而對(duì)質(zhì)體和線粒體傳遞方式及其遺傳機(jī)理進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析［5，20－21］。本研究應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)，對(duì)毛白楊等花粉發(fā)育過(guò)程中質(zhì)體和線粒體在生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的分布與變化進(jìn)行了觀察，旨在揭示白楊派樹(shù)種細(xì)胞質(zhì)遺傳方式和遺傳機(jī)理，闡明父系細(xì)胞器及其DNA丟失的機(jī)理，并填補(bǔ)該領(lǐng)域的研究空白。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取白楊派樹(shù)種:毛白楊5041♂(山東冠縣)，毛新楊TB13♂(中國(guó)農(nóng)大家屬院)，銀腺楊2號(hào)♂(山東冠縣)，中國(guó)山楊8號(hào)♂(北京妙峰山);取上述材料不同發(fā)育時(shí)期的花藥、花粉制作普通光鏡、透射電鏡觀察的樣品，用醋酸洋紅鏡檢確定花藥、花粉發(fā)育時(shí)期。

1.2 超薄切片的制備與透射電鏡觀察

為了觀察不同時(shí)期生殖細(xì)胞質(zhì)體和線粒體的存在狀況，取單核花粉、2－細(xì)胞早期花粉、成熟期花粉按下列程序制作電鏡樣品。參考胡適宜［20］、Sodmergen［3］和 Liu［21］的方法，制備樣品時(shí)，先用醋酸洋紅染色確定花藥發(fā)育時(shí)期，然后分別將不同發(fā)育時(shí)期的花藥或花粉粒收集于2.5%戊二醛溶液中(0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液配制，pH值7.2)，室溫固定4 h，用不含固定劑的相同緩沖液清洗4次，每次15 min，材料轉(zhuǎn)入1%鋨酸室溫固定1 h后放入冰箱中4℃過(guò)夜。次日棄去固定液，固定的材料經(jīng)清洗4次和系列酒精脫水后，用還氧丙烷過(guò)渡后包埋于Spurr環(huán)氧樹(shù)脂中，包埋后的材料在LKB－V型切片機(jī)上用鉆石刀切片，將切片用pH值7.4的TBO染色液復(fù)染，在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察，確定花粉粒內(nèi)細(xì)胞的輪廓，以區(qū)分生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。然后用銅網(wǎng)收集切片，1%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛先后染色，清洗后在 JOEL JEM －1010 透射電鏡下觀察和照相［3，21－22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)體和線粒體在生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中的分布與變化

2.1.1 單核花粉

小孢子單核靠邊期，細(xì)胞的中央出現(xiàn)了一個(gè)很大的液泡，占據(jù)了細(xì)胞絕大部分的空間，只在細(xì)胞的邊緣有一薄層細(xì)胞質(zhì)，在液泡邊緣的細(xì)胞質(zhì)可以觀察到質(zhì)體和線粒體。凸透鏡狀的細(xì)胞核處于貼壁的位置，超微切片電鏡觀察顯示，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含豐富的質(zhì)體和線粒體，一般來(lái)說(shuō)質(zhì)體較大，呈圓形或橢圓形，基質(zhì)較濃，線粒體較小，呈圓形，具有內(nèi)嵴(圖1a－b)。

2.1.2 2 －細(xì)胞早期花粉

小孢子有絲分裂前，細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器的分布發(fā)生變化，大多移向靠大液泡的一端，質(zhì)體和線粒體同樣表現(xiàn)明顯的極性化，它們大多分布在將成為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的一極(圖1c)。當(dāng)小孢子有絲分裂結(jié)束時(shí)，產(chǎn)生1個(gè)大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和1個(gè)小的生殖細(xì)胞，早期的生殖細(xì)胞呈凸透鏡形，一面與花粉壁緊貼著，向著營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的另一面壁較厚，在電子顯微鏡下為透明狀(圖1d－g)。上述細(xì)胞器的極性分布導(dǎo)致了在分裂后形成的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞含有大量的線粒體和質(zhì)體，而在生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中僅有少量的線粒體，缺少質(zhì)體(圖1d－e)。董源曾在普通光鏡下觀察到毛白楊第1次有絲分裂時(shí)多為不均等分裂，成膜體在生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞之間形成一次彎曲的壁。因此營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞比生殖細(xì)胞大的多，約占整個(gè)細(xì)胞體積的3/4～4/5。生殖細(xì)胞呈凸透鏡形緊靠花粉的一側(cè)［23］。崔彬彬等曾利用DAPI熒光壓片在毛新楊、銀腺楊花粉發(fā)育過(guò)程中也觀察到了這種不均等分裂［14］。(圖1f－g)顯示銀腺楊貼壁期的生殖細(xì)胞表現(xiàn)特殊，細(xì)胞質(zhì)中除了線粒體，還有1～2個(gè)質(zhì)體的分布。

2.1.3 成熟期花粉

隨著花粉的發(fā)育，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中液泡變小，在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中質(zhì)體轉(zhuǎn)變成造粉質(zhì)體，含大量淀粉顆粒。這為材料的固定、樹(shù)脂浸透及超薄切片造成了一定的困難，導(dǎo)致質(zhì)體和線粒體的切片觀察效果不夠理想。生殖細(xì)胞貼壁后期，向著營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的壁已開(kāi)始變薄，核占據(jù)細(xì)胞很大的面積。細(xì)胞質(zhì)中仍有一定數(shù)量的線粒體存在，缺少質(zhì)體。生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中質(zhì)體和線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分裂前的小孢子中的相似(圖1h)。生殖細(xì)胞脫離花粉內(nèi)壁，游離于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中央，細(xì)胞變?yōu)榍蛐?，?xì)胞壁薄并且與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)界限不明顯(圖1i)，此時(shí)在生殖細(xì)胞的一個(gè)切面上仍可以觀察到線粒體的存在(圖1j)。生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中質(zhì)體和線粒體存在的狀況與貼壁時(shí)期沒(méi)有明顯變化，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)中開(kāi)始出現(xiàn)大量的脂體(圖1k)。關(guān)于花粉不同發(fā)育時(shí)期，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中質(zhì)體的變化，胡適宜和羅玉英［22］也曾在玉竹(Polygonatum odoratum)雄配子體發(fā)育過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中的質(zhì)體發(fā)生明顯的變化:在早期的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)中，含有豐富的造粉質(zhì)體;在花粉發(fā)育后期，脂體增加而造粉質(zhì)體消失;接近成熟時(shí)花粉富含油滴。

董源在毛白楊花粉超微切片的橫切面觀察到2層同心圓結(jié)構(gòu)的質(zhì)體［23］。相同的現(xiàn)象也出現(xiàn)在毛白楊5041的成熟花粉中，在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)體的內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)達(dá)，組成同心環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而線粒體染色較淺，內(nèi)嵴發(fā)達(dá)(圖1l－n)。

在成熟花粉中，生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)核均高度伸長(zhǎng)，超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞2端的細(xì)胞質(zhì)延伸，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞質(zhì)中存在電子透明的小泡和線粒體，該線粒體染色較深，內(nèi)嵴明顯，同樣不存在質(zhì)體(圖1o－p)。營(yíng)養(yǎng)核隨著細(xì)胞的延長(zhǎng)也變?yōu)椴灰?guī)則及深的裂瓣，并形成許多凸起，核周?chē)芯€粒體和質(zhì)體分布(圖1q－r)。董源在毛白楊［23］、袁宗飛在旋花科植物［2］、牛建功在旱金蓮(Tropaeolum majus)［24］中都發(fā)現(xiàn)了生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)核的不規(guī)則形狀。

2.2 細(xì)胞質(zhì)中質(zhì)體和線粒體與熒光點(diǎn)關(guān)系的鑒定

在DAPI染色壓片下曾經(jīng)觀察到白楊生殖細(xì)胞周?chē)募?xì)胞器熒光點(diǎn)有2類:一類大而較亮，一類小而較暗［14］。為了鑒定這2類熒光點(diǎn)是否分別代表了質(zhì)體和線粒體的類核熒光，將熒光觀察過(guò)的切片用Spurr環(huán)氧樹(shù)脂重新包埋，制作電鏡觀察樣品，進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察。對(duì)比熒光點(diǎn)，以及超微結(jié)構(gòu)中質(zhì)體和線粒體在生殖細(xì)胞中的分布位置和大小差異，可以判斷大而亮的熒光點(diǎn)是質(zhì)體熒光點(diǎn)，小而暗的熒光點(diǎn)是線粒體熒光點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)，觀察白楊派樹(shù)種毛白楊、毛新楊、銀腺楊、中國(guó)山楊花粉發(fā)育中質(zhì)體和線粒體在生殖細(xì)胞、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中的分布與變化。結(jié)果表明:質(zhì)體和線粒體的遺傳是相互獨(dú)立的，具體表現(xiàn)為在小孢子第1次有絲分裂時(shí)質(zhì)體由于極性分布，導(dǎo)致早期的生殖細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)已不含質(zhì)體，為白楊派樹(shù)種質(zhì)體母系遺傳提供了確切的細(xì)胞學(xué)證據(jù);而線粒體在花粉發(fā)育過(guò)程中一直存在。同時(shí)，細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)銀腺楊少數(shù)質(zhì)體被排除的時(shí)期相對(duì)遲緩。但是，不同發(fā)育時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的質(zhì)體和線粒體。筆者結(jié)合以往的研究工作，對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行討論。

Hagemann等［25］以4個(gè)屬植物為代表提出了在被子植物中父系質(zhì)體傳遞的4種方式，除天竺葵屬型(Tilney－Bassett type)精細(xì)胞含質(zhì)體并傳遞至合子，被確定為質(zhì)體雙親遺傳外，其余的番茄屬型(Lycopersion type)、茄屬型(Solanum type)和小麥屬型(Triticum type)3種類型質(zhì)體在雄性細(xì)胞的發(fā)育或受精過(guò)程中被排除，這是質(zhì)體母系遺傳的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果證明白楊派樹(shù)種毛白楊、毛新楊、銀腺楊和中國(guó)山楊雄性質(zhì)體在小孢子有絲分裂時(shí)由于極性化分布被排除，導(dǎo)致剛形成的生殖細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不含質(zhì)體，與番茄屬型的特征一致，而與Russell認(rèn)為美洲黑楊質(zhì)體在受精時(shí)被排除，把楊樹(shù)細(xì)胞質(zhì)遺傳歸為小麥屬型［10］的觀點(diǎn)不同。在白楊派樹(shù)種生殖細(xì)胞形成和發(fā)育各時(shí)期雖然均存在線粒體，以往的DNA熒光觀察可以確定線粒體DNA在生殖細(xì)胞不同發(fā)育時(shí)期已降解［14］，這是其母系遺傳的重要機(jī)制。這一結(jié)果說(shuō)明白楊的質(zhì)體遺傳和線粒體遺傳是在相互獨(dú)立機(jī)制下進(jìn)行的，類似于Sodmergen［3］，Liu 等［21］的研究結(jié)果。

圖1 超薄切片透射電鏡觀察

許多學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞器的極性分布可能是細(xì)胞骨架在起作用［26］。Schr?der［27］在脂麻掌(Gasteria verrucosa)的研究中，推測(cè)質(zhì)體和其它細(xì)胞器在胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和定位似與肌動(dòng)蛋白微絲有關(guān)。Huang等［28］在白花丹(Plumbago)的生殖細(xì)胞中觀察到細(xì)胞器與微管連結(jié)，認(rèn)為細(xì)胞器的極性分布是微管起作用。蔡雪研究朱頂紅(Hippeastrum rutilum)、高原卷丹(Lilium davidii var.Unicolor)花粉粒和花粉管中細(xì)胞骨架時(shí)發(fā)現(xiàn)，正?；ǚ坌℃咦硬痪扔薪z分裂是由微管系統(tǒng)決定的，而秋水仙素和高溫(32℃)能影響微管從而導(dǎo)致小孢子的對(duì)稱分裂［27］。早期董源觀察鄭州地區(qū)和北京地區(qū)毛白楊的有性生殖過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，毛白楊單核花粉有絲分裂多不均等，少為均等分裂［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，白楊派樹(shù)種花粉第1次有絲分裂的不均等分裂，使質(zhì)體被排除在生殖細(xì)胞以外，不參與授精過(guò)程，是質(zhì)體母系遺傳的主要原因。秋水仙素人工誘變多倍體原理也是通過(guò)抑制紡錘體微管生成，阻止減數(shù)分裂時(shí)期染色體分離。據(jù)此，筆者打算通過(guò)進(jìn)一步的研究工作，搞清幾個(gè)問(wèn)題:①在人工誘變多倍體過(guò)程中，秋水仙素、高溫等誘變條件能否抑制微管作用，從而影響包括質(zhì)體在內(nèi)的細(xì)胞器的極性分布，進(jìn)而引起細(xì)胞質(zhì)遺傳方式的改變。②在對(duì)核基因組實(shí)施加倍的同時(shí)，是否也導(dǎo)致了細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的加倍。筆者等曾經(jīng)對(duì)不同加倍方式所得三倍體毛白楊葉綠體性狀變異進(jìn)行了研究［13］，發(fā)現(xiàn)大部分三倍體毛白楊與二倍體親本在葉綠體大小上差異不大;葉綠體數(shù)目則因倍數(shù)的增加而增加，其中卵細(xì)胞染色體加倍獲得的三倍體達(dá)到極顯著水平;在單位體積、單個(gè)細(xì)胞葉綠體DNA含量方面，花粉染色體加倍獲得的三倍體比卵細(xì)胞染色體加倍獲得的三倍體表現(xiàn)突出，其中葉綠體大小與單位體積的個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān)變化，單位體積葉綠體DNA量的增加與葉綠體大小和單位體積葉綠體數(shù)目關(guān)系不大。以上結(jié)果是否與不同加倍方式有關(guān)?葉綠體數(shù)目的增加是否由于加倍作用引起質(zhì)體極性化分布異常?花粉染色體加倍導(dǎo)致核基因組加倍的同時(shí)，是否也導(dǎo)致了葉綠體基因組的加倍?這些問(wèn)題今后需要進(jìn)一步深入研究。

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