NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化早期和晚期結(jié)構(gòu)蛋白的變化

侯 澍 張 磊 李紅杰 胡林森

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100038)

神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì)之一，它掌控著神經(jīng)元的生存、分化、生長發(fā)育、凋亡等重要生理功能，也參與受損神經(jīng)的再生和功能修復(fù)〔1〕。本研究在建立NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化過程的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，探索細(xì)胞形態(tài)變化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM購自Gibco公司。神經(jīng)生長因子購自廈門北大之路生物工程有限公司。CyDye熒光標(biāo)記物、24 cm固相pH梯度干膠條、胰蛋白酶、Clean-up試劑盒、2D Quant定量試劑盒等均購自GE Healthcare-Biosciences公司。谷氨酰胺、hACTH(19～39)和AngⅢ均購自美國Sigma公司。倒置相差熒光顯微鏡為日本O-lympus產(chǎn)品;蛋白質(zhì)組學(xué)設(shè)備由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化模型的建立 PC12細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%新生牛血清、1%谷氨酰胺)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將同一批細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，按1×105個(gè)/ml密度接種，培養(yǎng)24 h后，在實(shí)驗(yàn)組中加入50 ng/ml NGF，而在對照組中加入等體積培養(yǎng)液。給藥后分別于0、6、96 h進(jìn)行吖啶橙和溴化乙啶染色，之后觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析 選取四批不同代數(shù)的細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入NGF、對照組中加入培養(yǎng)液，再培養(yǎng)6 h或96 h。小心刮取細(xì)胞，2 000 r/min、4℃離心5 min，向沉淀中加入細(xì)胞裂解液，19 500 r/min、室溫離心30 min，取上清。應(yīng)用Clean-up試劑盒去除樣品雜質(zhì)，2D Quant定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。分別以1μl CyDye(Cy3、5)工作液標(biāo)記相應(yīng)的蛋白樣品，用4μl Cy2工作液標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，冰浴避光30 min。按照蛋白質(zhì)組學(xué)的操作說明，將3種熒光標(biāo)記的樣品混合在一起，上樣至相應(yīng)膠槽中，固相pH梯度干膠條放入膠槽，然后置于Ettan IPGphorⅡ等電聚焦電泳儀上，按自動(dòng)程序進(jìn)行水化與等電聚焦。經(jīng)2次平衡，將IPG膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的SDS-PAGE膠上端，進(jìn)行電泳。用Typhoon 9400激光掃描儀進(jìn)行掃描，用DeCyder差異分析軟件，找出蛋白表達(dá)差異點(diǎn)。

1.4 差異蛋白點(diǎn)的鑒定 從實(shí)驗(yàn)組和對照組中各取600μg蛋白，上述同樣方法進(jìn)行制備膠的制作，考馬斯亮藍(lán)染色。切取與差異表達(dá)點(diǎn)相匹配的蛋白點(diǎn)，用20 ng/μl胰蛋白酶將蛋白點(diǎn)于37℃酶切2 h。樣品與等體積基質(zhì)混勻后進(jìn)行點(diǎn)樣，將MALDI-TOF質(zhì)譜儀所測的肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)輸入NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果

2.1 NGF作用下PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 光鏡下動(dòng)態(tài)觀察NGF作用下PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，對照組大多數(shù)PC12細(xì)胞呈圓形，散在生長或聚團(tuán)生長，為未分化細(xì)胞(圖1A);而在NGF作用6 h以后細(xì)胞開始長出神經(jīng)突起(圖1B);至96 h時(shí)細(xì)胞變得扁平，呈梭形或多角形，胞體增大，48%的細(xì)胞長出長突起，不同細(xì)胞的突起可連接成網(wǎng)(圖1C)。

圖1 對照組與NGF處理組PC12細(xì)胞的形態(tài)(吖啶橙和溴化乙啶染色，×200)

圖2 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化晚期MALDI-TOF MS鑒定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白

2.2 NGF誘導(dǎo)6 h和96 h細(xì)胞差異表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白50 ng/ml NGF作用于PC12細(xì)胞6 h，提取全細(xì)胞蛋白，與對照組比較，質(zhì)譜鑒定后，沒有差異表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白被鑒定出來。

而用DeCyder BVA軟件分析NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化晚期(96 h)的細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)量差異，并進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，發(fā)現(xiàn)5種表達(dá)增高的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在雙向膠上分布見圖2A，其中點(diǎn)A為神經(jīng)絲蛋白-M(NF-M)，點(diǎn)B是神經(jīng)絲蛋白-L(NF-L)，點(diǎn)C為微管蛋白α-2(tubulinα-2)，點(diǎn)D是微管蛋白β-15(tubulinβ-15)，點(diǎn)E為原肌球蛋白(TM)。

3 討論

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，能合成、貯存并釋放適量的兒茶酚胺。用NGF處理該細(xì)胞，可使其分化為交感神經(jīng)元樣細(xì)胞，從而在形態(tài)、生理、生化及功能方面更接近于神經(jīng)元，是在分子水平上研究神經(jīng)元分化的重要模型。

與傳統(tǒng)生物化學(xué)方法相比，蛋白質(zhì)組學(xué)是一種高通量、高分辨率的蛋白質(zhì)研究方法，擯棄了對單一或少數(shù)蛋白質(zhì)分割式的研究模式，使得在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其特有的活動(dòng)規(guī)律成為可能，從而獲得有關(guān)蛋白質(zhì)性質(zhì)、表達(dá)變化及翻譯后修飾等方面的大規(guī)模信息。隨著研究不斷深入，蛋白質(zhì)組學(xué)在解釋諸如生長、發(fā)育、代謝調(diào)控等生命活動(dòng)規(guī)律上將有所突破，也將為探討重大疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和預(yù)防、新藥開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化96 h，神經(jīng)絲蛋白(NF-M和NF-L)、微管蛋白tubulinα-2和tubulinβ-15以及TM這5種細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)顯著增高，而NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化6 h，上述蛋白質(zhì)表達(dá)與對照組比較均無變化。

微管是細(xì)胞骨架中最粗的一種纖維絲，是細(xì)胞內(nèi)囊泡、細(xì)胞器和蛋白質(zhì)交通運(yùn)輸?shù)能壍馈Ｎ⒐艿鞍诪榍蛐畏肿?，分為兩種類型:α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，這兩種微管蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，能夠緊密地結(jié)合成二聚體，作為微管組裝的亞基，能夠聚合并且參與細(xì)胞分裂。β-tubulin有Ⅰ～Ⅵ六種亞型，其中Ⅱ、Ⅲ型是神經(jīng)元特異性蛋白，在NGF作用于PC12細(xì)胞時(shí)其表達(dá)量增高數(shù)倍〔2〕。本實(shí)驗(yàn)中β-tubulin含量顯著增高可能是Ⅱ、Ⅲ型β-tubulin表達(dá)上調(diào)所致。

NF是神經(jīng)元特有的中間絲蛋白(10～12 nm)，分為NF-L、NF-M和NF-H三種不同類型。它們與其他中間絲蛋白相互聚合形成網(wǎng)絡(luò)，主要起支持作用，是構(gòu)成神經(jīng)元骨架的主要成分。已有研究報(bào)道NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞中NF-L和NF-M表達(dá)增強(qiáng)〔3〕，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合。

微絲為直徑5～6 nm的雙股螺旋細(xì)絲，由肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和輔肌球蛋白組成。本實(shí)驗(yàn)中，點(diǎn)E被鑒定為TM，它是上述微絲收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。Barbara等曾報(bào)道:腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)作用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞使TM-3上調(diào)，而NGF處理的TrkA-SY5Y細(xì)胞中該蛋白表達(dá)下調(diào)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)中NGF處理組TM表達(dá)顯著增高，這可能是由不同細(xì)胞系和不同實(shí)驗(yàn)條件所造成。TM上調(diào)與NGF引發(fā)的PC12細(xì)胞分化、細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)增高等一系列現(xiàn)象相符，并可增強(qiáng)細(xì)胞的活動(dòng)能力。

比較NGF處理6 h和96 h兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):NGF處理96 h時(shí)PC12細(xì)胞發(fā)生顯著形態(tài)學(xué)變化，此時(shí)許多蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著變化。其中 NF-M、NF-L、tubulinα-2、tubulinβ-15和 TM等細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，這與細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察所見相符。這些差異主要反映了NGF形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞構(gòu)成變化的一致性。本實(shí)驗(yàn)為研究NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的機(jī)制提供了線索，也為深入進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)提供了新的線索。

1 孫小單，李羽佳，佟曉杰.神經(jīng)生長因子促進(jìn)神經(jīng)再生作用的研究進(jìn)展〔J〕.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010;31(4):377-80.

2 Joshi HC，Cleveland DW.Differential utilization of beta-tubulin iso-types in differentiating neurites〔J〕.JCell Biol，1989;109:663-73.

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4 Sitek B，Apostolov O，Stuhler K，et al.Identification of dynamic proteome changes upon ligand activation of Trk-receptors using two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis and mass spectrometry〔J〕.Mol Cell Proteomics，2005;4(3):291-9.