基于DcR3的樹(shù)突細(xì)胞疫苗對(duì)CD8+T細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)

李樹(shù)法 向 菲 李海英 黎姍姍 梁 愿 張 敏

(貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

誘騙受體3(DcR3)是最近新發(fā)現(xiàn)的能與淋巴毒素類(lèi)似物(LIGHT)、Fas配體(FasL)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并抑制其活性的腫瘤壞死因子(TNF)家族成員之一，對(duì)LIGHT和Fas兩大系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起重要的作用〔1，2〕。DcR3抑制了LIGHT及FasL介導(dǎo)的凋亡，有助于腫瘤細(xì)胞、活化的自身免疫細(xì)胞免受機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除，從而被認(rèn)為與某些腫瘤、自身免疫病的發(fā)病有關(guān)，因此是一種具有免疫抑制作用的分子〔3～5〕。本研究擬將DcR3腺病毒轉(zhuǎn)染到樹(shù)突細(xì)胞(DC)表面，制備DcR3特異的DC疫苗，觀(guān)察該疫苗對(duì)同種異體的CD8+T細(xì)胞的免疫抑制作用，為自身免疫疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 8月齡Balb/c和C57BL/6小鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。重組DcR3(Ad-DcR3)腺病毒和攜帶β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的重組腺病毒(Ad-LacZ)由第三軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所提供，粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和 TNF-α 購(gòu)自美國(guó) R＆D systems，Minneapolis。CD8+T細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自Miltenyi公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液制備 頸椎脫臼法處死小鼠，無(wú)菌分離小鼠脾臟放于冷Hank液中，剪碎并反復(fù)碾磨通過(guò)200目的無(wú)菌銅網(wǎng)，收集懸液并用紅細(xì)胞溶解液去除紅細(xì)胞，再用大量Hank's液洗滌細(xì)胞2次，1 200 r/min離心10 min，用RPMI1640培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)。

1.2.2 免疫磁珠分選(MACS)純化CD8+T細(xì)胞 取4×107細(xì)胞，1 200 r/min離心10 min，去上清液后用160μl緩沖液重懸，加40μl抗體Cocktail充分混勻，4℃孵育10 min。加160μl緩沖液，1 200 r/min離心10 min，去上清液，再加入320μl緩沖液、80μl磁性微珠，充分混勻，4℃孵育15 min。用適量緩沖液沖洗，1 200 r/min離心10 min。吸除上清液，用500μl緩沖液重懸細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過(guò)濾成無(wú)氣泡的單細(xì)胞懸液。將MS細(xì)胞分離柱置于MACS磁力架上，先用500μl緩沖液洗柱，再將細(xì)胞懸液通過(guò)MS柱，1 500μl緩沖液洗滌，收集流出液體，離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

1.2.3 DC的培養(yǎng)及鑒定 取8周齡Balb/c小鼠，脫頸處死，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液浸泡5 min，無(wú)菌條件下切開(kāi)皮膚及皮下組織，分離小鼠股骨和脛骨，用濃度為0.01 mol/L的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3～5次，剪斷股骨和脛骨兩端，用濃度為0.01 mol/L的無(wú)菌PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心 5 min去掉脂肪層，細(xì)胞用濃度為0.01 mol/L的無(wú)菌PBS重懸，再緩慢加入等體積Percoll細(xì)胞分離液，3 000 r/min離心 30 min，收集單核細(xì)胞，用濃度為0.01 mol/L的無(wú)菌PBS洗滌2次，再用含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，所得單細(xì)胞懸液接種于T-25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并補(bǔ)充GM-CSF和IL-4，置溫度為37℃、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日半量換液補(bǔ)充細(xì)胞因子，第7天收獲細(xì)胞，即得DC。采用光鏡觀(guān)察DC的形態(tài)。

1.2.4 重組酶腺病毒對(duì)DC的體外轉(zhuǎn)染 將DC置于6孔培養(yǎng)板中，每孔3×106個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組每孔加入1×109Pfu的Ad-DcR3或Ad-LacZ重組腺病毒1 ml，空白對(duì)照組每孔加入1 ml PBS，在37℃5%CO2飽合濕度下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 Western印跡檢測(cè)DcR3蛋白的表達(dá) 收集感染48 h的各組細(xì)胞，提取總蛋白。取40μg蛋白樣品進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，半干轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h以封閉非特異反應(yīng)物。封閉后的膜與1∶100稀釋的DcR3一抗4℃孵育過(guò)夜。Tris緩沖液(TBS)洗膜，與1∶2 000稀釋的二抗孵育120 h。TBS洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑盒反應(yīng)3 min，膠片曝光，拍照。實(shí)驗(yàn)中以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 采用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，取Balb/c的DC與C57BL/6的CD8+T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，將兩種細(xì)胞混合置于96孔培養(yǎng)板，每孔分別加入細(xì)胞各100μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置入37℃、5%CO2的孵育箱中，分別培養(yǎng)72 h。

1.2.7 淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 細(xì)胞混合培養(yǎng)后，每孔加入0.1 ml濃度為1×103μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用PBS漂洗細(xì)胞3次，甲醛固定10 min，再用4℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5 ml濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移入閃爍瓶中，加入5 ml閃爍液，用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)每分鐘的閃爍次數(shù)(cpm)，測(cè)定DPM值(反映細(xì)胞DNA合成速率)，重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.8 細(xì)胞因子的ELISA檢測(cè) 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，取培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中的γ-干擾素(IFN-γ)水平。具體步驟參照試劑說(shuō)明書(shū)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DC的光鏡觀(guān)察結(jié)果 用光鏡觀(guān)察DC的形態(tài)，DC誘導(dǎo)成熟后，細(xì)胞呈不規(guī)則形，并形成大量的毛刺突出。證明經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，可以誘導(dǎo)脾臟單個(gè)細(xì)胞向DC的分化。見(jiàn)圖1。

圖1 DC的形態(tài)觀(guān)察結(jié)果(×40)

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與Western印跡分析結(jié)果 將Ad-DcR3對(duì)DC進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Western印跡分析DcR3的表達(dá)情況。Ad-DcR3可介導(dǎo)DcR3的有效表達(dá)，而陰性對(duì)照則未出現(xiàn)條帶。見(jiàn)圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)DcR3的表達(dá)

2.3 淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè) Ad-DcR3組的CD8+T細(xì)胞cpm值為36 000±3 400，Ad-LacZ組為51 000±4 800，PBS組為54 000±6 500。實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染Ad-DcR3的DC對(duì)同種異體的CD8+T細(xì)胞具有抑制增殖的作用(P＜0.05)。

2.4 淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的檢測(cè) Ad-DcR3組的CD8+T細(xì)胞 IFN-γ分泌值為(42.8±5.7)pg/ml，Ad-LacZ組為(98.4±11.9)pg/ml，PBS組為(96.5±10.2)pg/ml。實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染Ad-DcR3的DC對(duì)同種異體的CD8+T細(xì)胞具有抑制細(xì)胞因子分泌的作用。

3 討論

DcR3屬于TNF受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族的成員，其開(kāi)放閱讀框編碼300個(gè)氨基酸。其基因定位于20q13.3，含有4個(gè)半胱氨酸富集區(qū)〔6〕。它是一種表面受體，也是一種凋亡抑制蛋白(IAP)，DcR3的配體均是TNF家族成員，包括FasL、LIGHT和TL1A。它可干擾FasL或淋巴毒素β受體介導(dǎo)的凋亡，還可通過(guò)阻斷NFR-2和LIGHT之間的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、TL1A致死亡受體3(death receptor3，DR3)的單向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制T細(xì)胞共刺激〔7～9〕。因而DcR3在腫瘤逃逸及轉(zhuǎn)移、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)中扮演了重要的角色，可為這些疾病的診斷、治療、療效觀(guān)察和預(yù)后判斷提供新的思路，故逐漸受到人們的重視。

DC是目前體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞，是機(jī)體T細(xì)胞特異免疫應(yīng)答的直接啟動(dòng)和調(diào)控者〔10，11〕，其強(qiáng)大的專(zhuān)職性遞呈作用和啟動(dòng)初始T細(xì)胞的能力，日益成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。它最大的特點(diǎn)是能夠顯著刺激初始型T細(xì)胞增殖活化〔11～13〕，因此DC是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，在免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位。采用基因修飾方法制備DC疫苗用于主動(dòng)免疫治療是一種理想的免疫治療方法〔14，15〕。

為了證實(shí)DcR3基因修飾DC的免疫效應(yīng)，本研究將該基因修飾的DC刺激同種異體的CD8+T細(xì)胞，采用3H-TdR和ELISA法檢測(cè)DC對(duì)CD8+T細(xì)胞的免疫抑制情況。結(jié)果提示DcR3基因修飾DC能抑制同種異體的CD8+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子(IFN-γ)的分泌。因此，重組DcR3腺病毒轉(zhuǎn)染的DC對(duì)CD8+T細(xì)胞具有免疫抑制效應(yīng)，為下一步在自身免疫疾病的防治研究工作提供了工具和理論基礎(chǔ)。

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