AGEs對(duì)糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制

薛昊罡 冷 冰 馬恩元 蔣維海 崔 雙 單廣宇 苗婷婷

(北華大學(xué)第一臨床醫(yī)院骨外科，吉林 吉林 132011)

糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)生可能與晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)引起骨代謝紊亂有關(guān)。由于慢性高血糖導(dǎo)致AGEs積聚，使骨蛋白及骨細(xì)胞分化受到影響，骨代謝平衡失調(diào)，引發(fā)骨質(zhì)疏松。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)已被證明是成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化促進(jìn)因子，具有較強(qiáng)的促進(jìn)骨形成的作用〔1〕。目前，BMP-2的研究多集中于骨誘導(dǎo)及骨愈合方面，有關(guān)BMP-2在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在進(jìn)一步研究AGEs在分子水平對(duì)骨代謝影響的作用機(jī)制，為臨床預(yù)防及治療糖尿病骨質(zhì)疏松提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料 健康6個(gè)月齡Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，雌雄各半，體重170～220g，購(gòu)自北華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。所有大鼠均喂養(yǎng)于塑料鼠盒內(nèi)，專人飼養(yǎng)，每籠4只。飼養(yǎng)于北華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度70% ～75%，晝夜周期12h環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)2w，所有大鼠不限制飲食，自由攝入標(biāo)準(zhǔn)固體顆粒飼料(含1.13%鈣、0.66%磷，北華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)和自來(lái)水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后進(jìn)行分組飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合科學(xué)技術(shù)部2006年《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和糖尿病骨質(zhì)疏松組，每組12只，兩組大鼠的體重、月齡及喂養(yǎng)條件均無(wú)明顯差異，具有一致性(P＞0.05)。其中對(duì)照組大鼠均喂以普通飼料，糖尿病骨質(zhì)疏松組喂以高糖高脂飼料(普通飼料中添加10%豬油、10%蛋黃粉和20%蔗糖)喂養(yǎng)8w(不限每日熱量)，禁食12h后一次性左下腹腔注射 STZ(65mg/kg體重)，正常對(duì)照組腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。2w后，每周固定時(shí)間大鼠尾靜脈采血測(cè)血糖，做腹腔內(nèi)葡萄糖耐量(Intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT)。方法為:大鼠禁食6～8h，按2g/kg體重腹腔注射30%葡萄糖溶液，尾靜脈采血測(cè)定 0、30、60、120min血糖，以空腹血糖(FPG)≥7.0mmol/L，或糖負(fù)荷后2h血糖≥11.1mmol/L者為糖尿病造模成功鼠〔2〕。成模后所有大鼠每周固定時(shí)間測(cè)血糖和體重，持續(xù)觀察20w。剔除死亡和造模未成功大鼠，糖尿病骨質(zhì)疏松組最后納入統(tǒng)計(jì)的大鼠為10只。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.2.1 標(biāo)本取材與保存 各組動(dòng)物在完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程后、處死取材前進(jìn)入代謝籠，收集24h尿液，經(jīng)腹腔靜脈抽血處死，取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物第2腰椎椎體〔3〕。尿和血標(biāo)本及時(shí)檢驗(yàn)或放入低溫冰箱保存，骨標(biāo)本分別在低溫冰箱、液氮或甲醛固定保存。1.2.2.2 血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定 血清Ca、P、FPG、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的測(cè)定由全自動(dòng)生化分析儀使用比色法測(cè)定，抗凝血糖化血紅蛋白(HbA1c)的測(cè)定采用比色法，血清胰島素(INS)、白介素(IL)-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-I、BGP的測(cè)定采用放射免疫法，用Hitachi-850型熒光分光光度計(jì)測(cè)定血清中AGEs的含量〔4〕。公式計(jì)算如下:IAI=In(1/FINS×FPG)，IR=FPG ×FINS/22.5。

1.2.2.3 骨形態(tài)學(xué)計(jì)量測(cè)定 采用美國(guó)GDR-2000型Hologac雙光能X射線骨密度儀測(cè)量大鼠腰椎、股骨及脛骨及總骨密度。應(yīng)用CMIAS型北航多功能病理彩色圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均骨小梁寬度、平均骨皮質(zhì)厚度、骨小梁百分比、平均骨小梁間距〔5〕。

1.2.2.4 骨組織中BMP-2的免疫組織化學(xué)染色 用實(shí)驗(yàn)大鼠椎體松質(zhì)骨作為實(shí)驗(yàn)材料，取第2腰椎的錐體，4%多聚甲醛固定，15%EDTA溶液脫鈣，梯度酒精逐級(jí)脫水后，石蠟包埋、切片，用1∶200兔抗大鼠BMP-2多克隆抗體作為第一抗體，1∶200生物素化山羊抗兔IgG作為第二抗體，DAB顯色，顯微鏡下觀察有棕黃色物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)停止，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片〔6〕。

1.2.2.5 骨組織中BMP-2的原位雜交 用實(shí)驗(yàn)大鼠椎體松質(zhì)骨作為實(shí)驗(yàn)材料，處死大鼠后，剝離出腰椎椎體，置于4%多聚甲醛固定，經(jīng)20%EDTA脫鈣，乙醇上行梯度脫水，石蠟包埋，骨縱行切片(6μm厚)后按BMP-2原位雜交試劑盒進(jìn)行操作，具體操作步驟如下:①使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。②根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。③加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50μl于反應(yīng)孔，加入待測(cè)樣品50μl于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50μl生物素標(biāo)記的抗體〔7〕。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1h。④甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加1次。⑤每孔加入80μl的親和鏈霉素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30min。⑥甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加1次。⑦每孔加入底物A、B各50μl，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10min。避免光照。⑧取出酶標(biāo)板，迅速加入50μl終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。⑨在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，結(jié)果用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重變化 糖尿病組大鼠與正常對(duì)照組大鼠相比，在食用高脂飲食后體重迅速增長(zhǎng)，并在高脂飲食8w后明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);而在注射STZ后糖尿病組大鼠的體重增長(zhǎng)明顯緩慢，至20w實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 兩組大鼠血糖變化 單純給予高脂飲食對(duì)兩組大鼠的血糖無(wú)明顯影響，但注射STZ后糖尿病組的血糖明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 兩組大鼠代謝相關(guān)生化指標(biāo)和細(xì)胞因子的變化 糖尿病組大鼠的血清鈣、磷水平與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異(P＞0.05);血清 TG、TC、BGP、IGF-1、IL-6 等與對(duì)照組相比有明顯差異(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表1 注射STZ前后兩組大鼠體重變化情況(x ± s，g)

表2 注射STZ前后兩組大鼠血糖變化情況(x ± s，mmol/L)

表3 兩組大鼠代謝相關(guān)生化指標(biāo)和細(xì)胞因子的變化情況(x±s)

表4 兩組大鼠血清AGEs、HbAlc、INS及IR的變化情況比較(x±s)

2.4 兩組大鼠血清AGEs、HbAlc、INS及IR的變化 糖尿病組大鼠血清AGEs、HbAlc、INS及IR等指標(biāo)與正常對(duì)照組相比有明顯差異(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 兩組大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的變化 糖尿病組大鼠的骨小梁相對(duì)體積、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量及骨小梁分離度等骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)靜態(tài)指標(biāo)與對(duì)照組相比均有明顯差異(P＜0.05)。見(jiàn)表5。另外，由表6可知糖尿病組大鼠的骨礦化沉積率、骨形成率及單位骨小梁面積上破骨細(xì)胞數(shù)等骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)動(dòng)態(tài)指標(biāo)與對(duì)照組相比均有明顯差異(P＜0.05)。兩組大鼠的股骨和脛骨X線片見(jiàn)圖1。

表5 兩組大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)靜態(tài)指標(biāo)的變化(x±s)

表6 兩組大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)動(dòng)態(tài)指標(biāo)的變化(x±s)

圖1 對(duì)照組及糖尿病組大鼠股骨和脛骨的X線攝片

2.6 BMP-2蛋白表達(dá)及平均光密度值 BMP-2蛋白主要沉積于骨細(xì)胞。對(duì)照組大鼠骨組織BMP-2蛋白表達(dá)強(qiáng)烈且廣泛，染色深，有的甚至成片狀;糖尿病組亦出現(xiàn)BMP-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，但均散在且淡染。見(jiàn)圖2。糖尿病組的BMP-2蛋白表達(dá)染色平均光密度(1.29±0.29)較對(duì)照組(3.41±0.43)明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 BMP-2蛋白表達(dá)免疫組化染色

2.7 BMP-2mRNA表達(dá)及平均光密度值 糖尿病組原位雜交陽(yáng)性染色出現(xiàn)于部分成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞，陽(yáng)性著色較深;對(duì)照組原位雜交陽(yáng)性染色較廣泛出現(xiàn)于成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及部分間充質(zhì)細(xì)胞，陽(yáng)性著色深。見(jiàn)圖3。糖尿病組大鼠椎骨、脛骨上段BMP-2mRNA表達(dá)染色平均光密度(0.12±0.019)較對(duì)照組(0.21±0.031)明顯降低(P＜0.05)。

圖3 骨組織BMP-2mRNA表達(dá)情況

2.8 大鼠血清AGEs與BMP-2mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系血清AGEs與BMP-2mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 －0.715(P＜0.05)、－0.621(P＜0.05)。

3 討論

AGEs是體內(nèi)糖的醛基或酮基與蛋白質(zhì)等的自由氨基經(jīng)過(guò)非酶促糖基化反應(yīng)形成的一類復(fù)合物，這些復(fù)合物呈異質(zhì)性，棕褐色，具有熒光性和高度交聯(lián)性，正常情況下AGEs是機(jī)體組織重建和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所需的，過(guò)多積累則引起許多病理改變。本文研究結(jié)果顯示糖尿病組大鼠的AGEs水平較對(duì)照組明顯升高。這主要是由于AGEs抑制間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)增殖，誘導(dǎo)凋亡，并阻止其分化為脂肪組織、軟骨和骨組織，提示AGEs在老年糖尿病病人肌肉骨骼紊亂發(fā)病過(guò)程的毒害效應(yīng);AGEs介導(dǎo)的交聯(lián)大分子蛋白質(zhì)可溶性降低，對(duì)蛋白溶解酶的抵抗性增高，導(dǎo)致組織(如彈性膠原)理化和機(jī)械特性的改變。這與本文兩組大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)比較結(jié)果是一致的。Hein等〔8〕取自于骨質(zhì)疏松患者的骨樣本中，通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)存在骨蛋白的AGEs免疫反應(yīng)強(qiáng)烈區(qū)域，其與骨重建參數(shù)具有相關(guān)性。這一研究表明，骨蛋白及骨細(xì)胞分化也受AGEs積聚的影響。Yamamoto〔9〕研究表明，在糖尿病骨質(zhì)疏松患者當(dāng)中AGEs通過(guò)與細(xì)胞表面受體作用而導(dǎo)致骨形成減少，骨吸收增加。Lu〔10〕在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)IGF-1和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)下降，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的基因(Cbfa1/Runx-2和Dlx5)表達(dá)不足，導(dǎo)致骨形成降低。Santana〔11〕在糖尿病動(dòng)物的顱蓋骨組織間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞中，證實(shí)RAGE的表達(dá)上調(diào)。國(guó)內(nèi)張磊〔12〕等的研究證實(shí)了糖尿病大鼠血清AGEs明顯升高，骨密度則明顯降低。李濤等〔13〕的研究證實(shí)糖尿病大鼠存在著骨質(zhì)疏松現(xiàn)象，且AGEs明顯高表達(dá)。王秀玲〔14〕等證實(shí)患者AGEs結(jié)合細(xì)胞表面的RAGE產(chǎn)生過(guò)多的TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子，血清TNF-α、IL-6、EGF水平和BMD呈顯著負(fù)相關(guān)。國(guó)內(nèi)外的研究均提示了AGEs與糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病的相關(guān)性。

在骨的形成過(guò)程中，成骨細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、分化受多種因素的調(diào)節(jié)，其中BMP-2在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中起非常關(guān)鍵的作用〔15〕。BMP-2通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和促進(jìn)其他成骨因子的表達(dá)而促進(jìn)骨形成。BMP作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFβ)超家族，其中，BMP-2是骨誘導(dǎo)活性最強(qiáng)的一種〔16〕。離體的BMP-2可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞幼稚軟骨細(xì)胞或成熟軟骨細(xì)胞分化為較成熟的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞〔17〕。有報(bào)道IGF-1促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化以及促進(jìn)長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)可能是通過(guò)增加細(xì)胞中BMP-2基因表達(dá)所介導(dǎo)的〔18〕。有關(guān)AGEs與糖尿病骨質(zhì)疏松BMP-2基因表達(dá)相關(guān)性的研究等報(bào)道較少。目前有關(guān)AGEs與糖尿病骨組織中BMP-2基因相關(guān)性的研究罕見(jiàn)報(bào)道。本文研究結(jié)果顯示糖尿病組BMP-2在mRNA和蛋白表達(dá)水平均較正常對(duì)照組明顯降低，這表明糖尿病骨質(zhì)疏松可能與BMP-2的表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，AGEs和BMP-2均參與了糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展;而有效的血糖控制可減少AGEs生成，增加BMP-2的表達(dá)，從而延緩糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。

1 張艷紅，董 進(jìn).rhIGF-1對(duì)成骨細(xì)胞增殖、BMP-2及Cbfa1基因表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2010;16(3):157-60.

2 王 娟，陽(yáng)文琳，陳 雋.辛伐他汀對(duì)糖尿病大鼠骨組織BMP-2基因表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(7):834-6.

3 葛全勝，王壽宇，朱英會(huì)，等.降脂壯骨方劑含藥血清對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)基層醫(yī)藥，2009;16(10):1729-31.

4 SwarnkarG，SharanK，SiddiquiJA，etal.Anovelflavonoidisolatedfrom thesteam-barkofUlmusWallichianaPlanchonstimulatesosteoblastfunctionandinhibitsosteoclastandadipocytedifferentiation〔J〕.EurJPharmacol，2011;658(2-3):65-73.

5 TangDZ，YangF，YangZ，etal.PsoralenstimulatesosteoblastdifferentiationthroughactivationofBMPsignaling〔J〕.BiochemBiophysResCommun，2011;405(2):256-61.

6 OzkanZS，DeveciD，OnalanEtemE，etal.Lackofeffectofbonemorphogeneticprotein2and4genepolymorphismsonbonedensityinpostmenopausalTurkishwomen〔J〕.GenetMolRes，2010;9(4):2311-6.

7 PountosI，GeorgouliT，HenshawK，etal.Theeffectofbonemorphogeneticprotein-2，bonemorphogeneticprotein-7，parathyroidhormone，and platelet-derivedgrowthfactorontheproliferationandosteogenicdifferentiationofmesenchymalstemcellsderivedfromosteoporoticbone〔J〕.J OrthopTrauma，2010;24(9):552-6.

8 Hein，WeiH，LehmannG，etal.Advancedglycationendproductodificationofoneproteinsandboneremodelling:hypothesisandpreliminaryimmunohistochemicalfindings〔J〕.AnnRheumDis，2006;65:101.

9 YamamotoT.TheroleofAGEsforthepathogenesisofos-teopeniaindiabetesmellitus〔J〕.ClinCalcium，2006;16(8):62-6.

10 LuH，KrautD，GerstenfeldLC，etal.Diabetesinterfereswiththebone formationbyaffectingtheexpressionoftran-scriptionfactorsthatregulate osteoblastdifferentiation〔J〕.Endocrinology，2003;144:346-52.

11 SantanaRB，XuL，ChaseHB，etal.Aroleforadvancedglycationend productsindiminishedbonehealingintypediabetes〔J〕.Diabetes，2003;52:1502-10.

12 張 磊，李 牧，祁 磊，等，晚期糖基化終末產(chǎn)物在糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用及胰島素潛在的防護(hù)機(jī)制〔J〕.山東大學(xué)(醫(yī)學(xué)版)，2007;45(11):1148-52.

13 李 濤，郭洪敏，聶志奎，等.糖基化終末產(chǎn)物在糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松中的作用及阿司匹林干預(yù)性觀察〔J〕.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010;33(2):82-8.

14 王秀玲，張 穎，于文浩.糖骨康對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松患者血清降鈣素、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6含量的影響〔J〕.臨床薈萃，2007;22(4):286.

15 NoheA，KeatingP，PetersenNO.Signaltransductionofbonemorphogeneticproteinreceptors〔J〕.CellSignal，2004;16(3):291-9.

16 JiaTL，WangHZ，XieLP，etal.Daidzeinenhancesosteoblastgrowththat maybemediatedbyincreasedbonemorphogeneticprotein(BMP)production〔J〕.BiochemPharmacol，2003;65(5):709-15.

17 YehLC，AdamoML，OlsonMS，etal.Osteogenicprotein-1andin-sulinlikegrowthfactorIsynergisticallystimulateratosteoblasticcelldifferentiationandproliferation〔J〕.Endocrinology，1997;138(10):4181-90.

18 梁東春，王寶利，左愛(ài)軍，等.胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)成骨細(xì)胞中BMP-2、BMP-7基因表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2004;10(1):45-7.