植物雌激素α-玉米赤霉醇對(duì)去卵巢大鼠骨組織雌激素受體α和βmRNA的影響

李少春 段 斐 程 煒 高 文 崔 娜

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(OP)是一種婦女絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降導(dǎo)致的一種以骨轉(zhuǎn)換增加、骨量丟失為特征的骨代謝性疾病。傳統(tǒng)的治療方法主要為激素替代療法(HRT)，但是HRT長(zhǎng)期應(yīng)用所產(chǎn)生的不良反應(yīng)使其應(yīng)用受到很大限制。而α-玉米赤霉醇(α-ZAL)是一種新型植物雌激素，具有雌激素樣作用，而對(duì)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等發(fā)病率無(wú)明顯影響，甚至對(duì)子宮、乳腺具有潛在保護(hù)作用。α-ZAL具有改善絕經(jīng)后OP骨生物力學(xué)指標(biāo)的作用，能對(duì)絕經(jīng)后OP發(fā)生產(chǎn)生一定防治作用，但其具體機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬觀察應(yīng)用α-ZAL治療后去卵巢大鼠骨組織雌激素受體α和βmRNA的變化，為探討其防治絕經(jīng)后OP的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 α-ZAL(sigma公司);戊酸雌二醇片為廣州仙靈制藥公司生產(chǎn)(批號(hào):145A13);Trizol試劑為北京邁晨科技有限公司產(chǎn)品;一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司。大鼠ERα、β和β-actin引物，北京奧科生物公司合成。

1.2 動(dòng)物分組 6月齡雌性SD大鼠40只，體重250～300 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):906155。大鼠實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1 w后隨機(jī)分為空白對(duì)照(Sham)組、模型組、雌二醇(OVX+E2)組、α-ZAL組(OVX+α-ZAL)，每組10只。各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射(2 ml/kg)麻醉后，下腹正中備皮切口入腹，將卵巢牽拉出腹腔外，除Sham組外，其余各組結(jié)扎血管后完整切除雙側(cè)卵巢，Sham組開(kāi)腹后切除卵巢旁一小塊脂肪組織，不切除卵巢，然后將腹腔分層縫合。術(shù)后給予青霉素20萬(wàn)U肌肉注射抗炎，每天1次，連續(xù)3 d。手術(shù)后第3周開(kāi)始灌胃給藥，OVX+E2組給予戊酸雌二醇1 mg/kg，OVX+α-ZAL組給予α-ZAL 1 mg/kg，每日1次，Sham組和模型組灌胃相應(yīng)體積生理鹽水，連續(xù)灌胃12 w。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分離大鼠雙側(cè)脛骨，將附著于骨表面的肌肉及結(jié)締組織剔除干凈，雙側(cè)脛骨放入凍存管中，標(biāo)記后投入液氮保存。

1.3 各組大鼠骨組織中ERα和 βmRNA表達(dá)情況 Trizol一步法提取骨組織總RNA，應(yīng)用HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒擴(kuò)增 ERs基因片段。ERα上游引物為5'-AATTCTGACAATCGACGCCAG-3'，下游引物為 5'-GTGCTTCAACATTCTCCCTCCTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為345 bp;ERβ的上游引物為5'-TCACCGTCGAGCCTTAGTTC-3'，下游引物為 5'-TCTGCATAGAGGAGCGATGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為286 bp。以β-actin作為內(nèi)參照，上游引物為5'-ACTGGCATTGTGATGGACTC-3'，下游引物為5'-GGCAACATAGCACAGCTTCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為216 bp。擴(kuò)增條件為:45℃反轉(zhuǎn)錄30 min;95℃預(yù)變性2 min;94℃變性15 s，60℃退火、延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72℃終延伸5 min。

1.4 RT-PCR產(chǎn)物半定量分析 取10μl PCR產(chǎn)物，加入2μl上樣緩沖液，混勻，分別加入樣品，在1×TAE緩沖液中60 V電泳1 h，美國(guó)Bio-Rad公司凝膠成像儀下觀察拍照，掃描后應(yīng)用Molecular Analyst分析軟件，對(duì)陽(yáng)性電泳條帶進(jìn)行吸光度峰值下面積積分，將 ERα(或 ERβ)/β-actin的比值作為 ERα(或ERβ)mRNA表達(dá)水平的相對(duì)量

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS14.0軟件，結(jié)果以x±s表示，總體進(jìn)行方差分析，組間比較用LSD法。

2 結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示大鼠去卵巢后，ERα和βmRNA表達(dá)量較Sham組明顯降低(P＜0.05)，經(jīng)雌激素治療后，ERα和β mRNA出現(xiàn)上調(diào)(P＜0.05)，而α-ZAL能上調(diào)ERαmRNA水平，對(duì)于ERβmRNA與模型組比較無(wú)顯著差異(表1和圖1)。

表1 各組大鼠ERα和ERβmRNA表達(dá)情況(x±s)

圖1 各組大鼠脛骨ERα和βmRNA表達(dá)電泳結(jié)果

3 討論

雌激素是通過(guò)與其受體ER結(jié)合發(fā)揮作用的，ER屬于核受體超家族成員，主要包括兩種亞型:ERα和β，ERα是在1986年首先被克隆，隨后ERβ在1996年被克隆出來(lái)。ERs屬于甾體激素受體超家族，ERα和β結(jié)構(gòu)相似，因此其在功能上也有相似性。兩種ER在組織中分布不同，ERα主要存在于子宮和乳腺，而ERβ主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨、腎、肺等。ERs在骨骼細(xì)胞的密度極低，因此一直以來(lái)認(rèn)為雌激素對(duì)骨的作用是間接產(chǎn)生的，但隨著ERs在骨骼細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到骨骼是雌激素直接作用的靶器官，ERs在骨骼細(xì)胞上的表達(dá)與骨量增長(zhǎng)和維持有密切關(guān)系。雌激素可以與骨骼細(xì)胞上ERs特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動(dòng)，介導(dǎo)雌激素和骨吸收、骨形成之間的聯(lián)系，從而對(duì)骨代謝起重要調(diào)控作用。因而，ERs是調(diào)控骨吸收和骨形成的重要樞紐，也是絕經(jīng)后OP形成的重要樞紐。因此，研究ERs在OP發(fā)生過(guò)程中的作用及其變化對(duì)于更好地探明絕經(jīng)后OP的發(fā)病和藥物防治絕經(jīng)后OP的機(jī)制更為重要。雖然ERα和β結(jié)構(gòu)相似，但其在調(diào)節(jié)骨代謝過(guò)程中扮演了不同的角色，兩者在空間分布和表達(dá)數(shù)量上也存在一定差異。Onoe等〔1〕發(fā)現(xiàn)原代大鼠成骨細(xì)胞的ERβmRNA水平明顯高于ERαmRNA，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，ERβmRNA在松質(zhì)骨中的表達(dá)水平高于皮質(zhì)骨，這解釋了絕經(jīng)后小梁骨的受累程度較皮質(zhì)骨嚴(yán)重而容易骨折的原因。ERα和β對(duì)骨代謝的作用還存在一定差異。應(yīng)用基因敲除技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，ERα和β雖然共同參與雌激素的骨保護(hù)效應(yīng)，但這種效應(yīng)主要是由ERα介導(dǎo)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示骨組織細(xì)胞中ERβmRNA的表達(dá)較ERα高，與上述結(jié)果一致。

ERs主要存在于成骨細(xì)胞和生長(zhǎng)板的軟骨細(xì)胞，而破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中的表達(dá)水平較低。而且，隨著骨齡的增長(zhǎng)和骨細(xì)胞發(fā)育分化，ERs表達(dá)水平也呈現(xiàn)一定動(dòng)態(tài)變化。Lanyon等〔2〕發(fā)現(xiàn)，隨著增齡，骨細(xì)胞上的ERs密度逐漸減少。Onoe等還發(fā)現(xiàn)，隨著成骨細(xì)胞的分化成熟，ERβmRNA表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)性高表達(dá)，而ERαmRNA表達(dá)則呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。

骨組織中ERs表達(dá)還與體內(nèi)雌激素水平具有相關(guān)性，成骨細(xì)胞的分化程度及外界影響都可以改變ERs密度和兩種亞型比例〔3〕，劉博等〔4〕通過(guò)對(duì)不同月齡雌性大鼠成骨細(xì)胞中 ERα表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，ERα密度隨著月齡的改變和體內(nèi)雌激素變化而呈現(xiàn)規(guī)律性變化。ERα和β表達(dá)水平與體內(nèi)雌激素水平一致，并且雌激素受體表達(dá)有賴于體內(nèi)雌激素的存在，雌激素水平降低后可使雌激素受體表達(dá)減少。因此，婦女絕經(jīng)后由于體內(nèi)雌激素水平下降，可以引起骨組織ERs表達(dá)水平下降，從而使雌激素對(duì)骨的作用減弱，成骨細(xì)胞凋亡增加，骨形成受到抑制，導(dǎo)致絕經(jīng)后OP。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨量減少，可能與骨骼細(xì)胞中缺乏ERα有關(guān)。骨組織細(xì)胞中ERs密度可以決定OP發(fā)病以及疾病嚴(yán)重程度，ERs表達(dá)水平越低，OP也就越嚴(yán)重。應(yīng)用雌激素治療后，骨骼細(xì)胞內(nèi)ERs mRNA表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，使雌激素對(duì)骨骼細(xì)胞的作用增強(qiáng)，從而產(chǎn)生防治OP的作用。

本研究結(jié)果提示α-ZAL具有與雌激素類似的作用，也可以調(diào)節(jié)ERαmRNA的表達(dá)而對(duì)絕經(jīng)后OP產(chǎn)生治療作用，這可能是其防治絕經(jīng)后OP的作用機(jī)制之一。但由于α-ZAL雌激素作用較弱，對(duì)ERβmRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。

1 Onoe Y，Miyaura C，Ohta H，et al.Expression of estrogen receptor beta in rat bone〔J〕.Endocrinology，1997;138:4509-12.

2 Lanyon L，Armstrong V，Ong D，et al.Is estrogen receptorα key to controlling bone's resistance to fracture〔J〕.J Endocrinol，2004;182(2):183-91.

3 Waters KM，Rickard DJ，Riggs BL，et al.Estrogen regulation of human osteoblast function is determined by the stage of differentiation and the estrogen receptor isoform〔J〕.JCell Biochem，2001;83(3):448-62.

4 劉 博，陶樹(shù)清，尹文哲.雌性大鼠成骨細(xì)胞內(nèi)雌激素受體表達(dá)的研究〔J〕.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004;38(2):179-81.