硫酸鎂對小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護作用

楊衛(wèi)東 董銀鳳 朱旭友 呂鴻燕 陳前芬

(蚌埠醫(yī)學(xué)院機能實驗中心，安徽 蚌埠 233030)

缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高等特點，因此缺血性腦卒中的防治成為社會和醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重要課題。研究表明N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性在缺血性腦損傷中起關(guān)鍵的作用。當(dāng)NMDA受體興奮時，大量Ca2+內(nèi)流引起鈣超載。Mg2+是Ca2+的天然拮抗劑，可通過非競爭性抑制NMDA受體來有效減少Ca2+內(nèi)流，從而改善腦組織細(xì)胞損傷〔1〕。近年引起人們的重視。本研究利用小鼠全腦缺血再灌注損傷模型，通過觀察硫酸鎂(MgSO4)預(yù)處理及治療對小鼠全腦缺血再灌注一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及ATP酶的影響，探討MgSO4對腦缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 MgSO4注射液(購于揚州中寶公司)，NOS及NO測定試劑盒及鈉鉀、鈣鎂ATP酶活性測定試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)。FSH-2型高速電動勻漿器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠產(chǎn))，756-MC型紫外分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn))。

1.2 動物與分組 健康昆明種小鼠80只，體重(25±5)g，雌雄兼用，由我院實驗動物科提供。隨機均分為以下各組，假手術(shù)組:僅行手術(shù)，不實施腦缺血;再灌組:缺血30 min，再灌注1 h;MgSO4預(yù)處理組和治療組各分為低、中、高劑量組，分別于缺血前 30 min腹腔注射25、50、100 mg/kg MgSO4，然后缺血30 min，再灌注 1 h，和再灌后即刻給予腹腔注射 90、180、360 mg/kg MgSO4。前兩組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3 全腦缺血/再灌注損傷動物模型的建立 10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)小鼠腹腔注射麻醉。采用我室改進(jìn)的小鼠全腦缺血/再灌注損傷的動物模型〔2〕。全腦缺血30 min，予以解壓再灌60 min。

1.4 標(biāo)本制備及處理 各組動物動態(tài)觀察到預(yù)定的時間后，用20%烏拉坦過量麻醉處死，開顱，取左側(cè)大腦皮質(zhì)，稱重，制成10%組織勻漿，硝酸還原法測定NO含量，測定誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、總一氧化氮合酶(T-NOS)活性及考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。右半大腦10%甲醛溶液固定，48 h后于乳頭體及視交叉平面行冠狀切開，制成腦片，HE染色，光鏡觀察腦皮層病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行單因素方差分析和q檢驗及t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)檢查結(jié)果 假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞胞膜清晰完整，無變性、水腫，核仁清晰可見。再灌注組神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞均腫脹、變性壞死，胞膜不清，胞核固縮，神經(jīng)纖維網(wǎng)呈空泡樣改變，間質(zhì)水腫明顯，細(xì)胞及血管周圍間隙增大。硫酸鎂治療和預(yù)處理各用藥組神經(jīng)細(xì)胞水腫程度有一定減輕，神經(jīng)細(xì)胞及間質(zhì)僅有輕微水腫，核仁清晰，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次較再灌組清楚各組之間差別不明顯，見圖1。

2.2 大腦內(nèi)NO含量和NOS、iNOS活性的變化 表1可見，腦內(nèi)NO含量和NOS、iNOS活性缺血再灌注組均高于假手術(shù)組，有顯著性差異(P＜0.01);MgSO4治療組和預(yù)處理各組腦組織T-NOS和iNOS活性及NO含量均低于再灌組有顯著性差異(P＜0.01)，MgSO4治療組各不同劑量治療組間均有差異(P＜0.05)。MgSO4預(yù)處理高劑量組的T-NOS活性與中、低劑量組比較有顯著性差異(P＜0.05)，而中劑量組與低劑量組比較無顯著性差異(P＞0.05)。NO含量、iNOS活性不同劑量MgSO4預(yù)處理各組間相比均無差異(P＞0.05)。MgSO4治療組和預(yù)處理T-NOS和iNOS活性的有顯著性差異(P＜0.01);NO含量高劑量組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 各組小鼠腦組織NO、T-NOS和iNOS活性比較(x ± s，n=10)

圖1 病理學(xué)檢查結(jié)果(HE，×400)

2.3 鈉鉀、鈣鎂-ATP酶 缺血再灌注組鈉鉀、鈣鎂-ATP酶的活性均低于假手術(shù)組和治療組、預(yù)處理組有顯著性差異(P＜0.05)。鈉鉀ATP酶預(yù)處理與治療組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);鈣鎂ATP酶預(yù)處理與治療組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 鈉鉀-ATP酶、鈣鎂-ATP酶活性比較(x ± s，n=10)

3 討論

隨著對腦損傷機制的認(rèn)識深入，MgSO4作為一種價廉而有效的腦保護劑備受人們關(guān)注，目前眾多研究表明，MgSO4是生理性的鈣拮抗劑和ATP酶活化劑〔1〕，還可以提高缺血組織中SOD等抗氧化酶活性，清除氧自由基〔3〕，抑制膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕自由基損傷。李鍵等〔4〕實驗表明，MgSO4預(yù)處理能降低NO含量和GSH活性，對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷起保護作用。我們的實驗結(jié)果表明在小鼠全腦缺血再灌注損傷時腦內(nèi)的iNOS及NO均顯著增加，腦組織病理學(xué)顯示腦組織的損傷加重。無論是MgSO4預(yù)處理還是治療均能減少iNOS及NO合成，組織病理學(xué)檢查也提示腦組織損傷明顯減輕。從而表明，腦缺血再灌注損傷后，腦內(nèi)興奮性氨基酸增多，NMDA受體激活，大量Ca2+內(nèi)流，還可增加iNOS mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而升高細(xì)胞內(nèi)NOS表達(dá)的水平。在NOS的作用下NO迅速合成，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷〔5〕。Mg2+是天然的鈣離子拮抗劑，同時作為一種非競爭性興奮性氨基酸(EAA)受體拮抗劑，具有阻斷NMDA受體，可阻滯興奮性氨基酸受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流，減輕興奮性毒性損傷的作用，并通過阻滯Ca2+內(nèi)流而最終抑制有害iNOS及NO合成，減輕腦組織損傷。

實驗和臨床均發(fā)現(xiàn)，急性缺血性腦卒中的動物或患者體內(nèi)都存在著嚴(yán)重的低鎂。Lampl等〔6〕對96例24～48 h以內(nèi)急性缺血性卒中患者入院時查血清和腦脊液鎂離子濃度，并用Mathew評分法評分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中發(fā)生后48 h神經(jīng)功能缺損的程度與腦脊液鎂濃度低有關(guān)。Heath等〔7〕用磷核磁共振波譜學(xué)方法研究證實，腦損傷時MgSO4和MgCl2均能透過血腦屏障進(jìn)入損傷組織。Fuchs-Buder等〔8〕對20例神經(jīng)外科病人靜脈注射MgSO4時鎂通過血腦屏障的研究證明，病人經(jīng)靜脈一次注射MgSO460 mg/kg，在注射后30、90和240 min時血清和腦脊液鎂離子濃度均增加。我們的實驗證明，隨著鎂濃度增高可提高對腦的保護作用，MgSO4血藥濃度與療效呈正相關(guān)。治療組在降低iNOS活性及NO含量作用比預(yù)處理組更明顯。

Mg2+是體內(nèi)一種內(nèi)源性保護因子，是體內(nèi)許多重要酶的輔助因子。不僅是生理性鈣拮抗劑還是ATP酶活化劑，在ATP的代謝和跨膜離子傳遞中起著極重要的作用。ATP酶是逆離子濃度梯度進(jìn)行細(xì)胞膜內(nèi)外轉(zhuǎn)運的離子泵，此過程需要能量。腦血流一旦完全阻斷，ATP耗盡，膜離子泵功能障礙，K+流出，Na+、Ca2+和水大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，使梗死灶周圍去極化，半暗帶功能損害。我們的實驗也表明，腦缺血再灌注損傷后，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均顯著降低。組織病理學(xué)表明腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞均極度腫脹。皮層充血，間質(zhì)水腫明顯。MgSO4預(yù)處理或治療后均顯示:Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均增高。腦組織輕度腫脹。變性壞死神經(jīng)細(xì)胞水腫程度減輕明顯。表明提高細(xì)胞外Mg2+可抑制K+外流，并可拮抗Ca2+離子內(nèi)流，從而減少自由基的產(chǎn)生，防止了神經(jīng)細(xì)胞的壞死與凋亡，保障了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

1 黃 越，王維治，張玉梅，等.硫酸鎂對大鼠急性缺血再灌注損傷時ATP酶的影響〔J〕.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2002;9(3):153-6.

2 陳前芬，祝曉光，楊衛(wèi)東，等.小白鼠全腦缺血∕再灌注損傷模型的改進(jìn)〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2000;16(5):577-9.

3 李增宏，羅 俊，林宏城，等.硫酸鎂注射液對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報論叢，2007;27(3):152-4.

4 李 鍵，董果雄，馮義柏.硫酸鎂預(yù)處理對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷的保護作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2006;26(9):1247-8.

5 季占勝，唐學(xué)東，閔連秋.硫酸鎂的腦保護作用〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2005;11(7):666-8.

6 Lampl Y，Geva D，Gilad R，et al.Cerebrospinal fluid magnesium level asa prognostic factor in ischemic stroke〔J〕.JNeurol，1998;245(9):5842-8.

7 Heath DL，Vink R.Neuroprotective effects of MgSO4and MgCl2in closed head injury:a comparative phosphorus NMR study〔J〕.J Neurotrauma，1989;15(3):183-9.

8 Fuchs-Buder T，Tramer MR，Tassonyi E.Cerebrospinal fluid passage of intravenous magnesium sulfate in neurosurgical patients〔J〕.JNeursurg Anesthesiol，1997;9(4):324-8.