非小細胞肺癌中HLA-G的表達及其與IL-10的相關性

宋新宇 陳世雄 曾凡軍 高寶安 楊衛(wèi)兵

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸內科，湖北 宜昌 443003)

HLA-G在腫瘤中的免疫抑制功能越來越受到關注。在惡性黑色素瘤〔1〕，腎細胞癌〔2〕，肺癌〔3〕，卵巢癌、乳腺癌〔4〕和神經膠質瘤中〔5〕均發(fā)現(xiàn)HLA-G蛋白的表達。HLA-G可阻止自然殺傷(NK)細胞的細胞溶解活性，誘導CD8+細胞毒性T細胞的凋亡和CD4+T細胞的同種增殖反應〔6〕。除這些細胞間的相互作用外，HLA-G還可通過調節(jié)細胞因子的釋放及促進輔助性T細胞比值(Th1/Th2)平衡向Th2方向的漂移來抑制免疫系統(tǒng)〔7〕。有報道顯示，Th2細胞因子中的IL-10誘導了HLA-G的表達，同時HLA-G似乎又反向刺激IL-10的表達〔8〕。而腫瘤細胞則可能通過該途徑對抗那些聚集到其周圍的免疫細胞〔9〕。本研究將探討HLA-G與IL-10在非小細胞肺癌標本中的表達及兩者的相關性。

1 材料與方法

1.1 患者和組織學標本 通過外科切除的方式獲得38例肺癌標本，這些患者術前均未接受放、化療。在切除腫瘤的同時獲取10例正常肺組織標本作為對照。這38位患者均來源于2007年5月至2008年6月間在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科住院患者，年齡32～75(平均62±12)歲，其中男27例，女11例。組織病理學分型:腺癌18例，鱗癌12例，大細胞癌8例。病理學分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例。所有組織標本被冰凍保存于－80℃。

1.2 RNA提取與cDNA合成 用RNA提取試劑盒(Invitrogen，USA)按照其說明書從冰凍組織樣本中提取總RNA。取1μg總RNA逆轉錄成cDNA存放于－20℃直到使用時。

1.3 實時定量PCR檢測HLA-G、IL-10 mRNA表達 用熒光實時定量PCR(Rotor-Gene RG-3000;Cobett Company，Australia)擴增目標cDNA序列。HLA-G和IL-10 PCR特異性擴增引物序列如下:HLA-G正義鏈5-CTGGAGAACGGGAAGGAGAT-3;反義鏈5-GGGTGGCCTCATAGTCAAAG-3。IL-10正義鏈5-ATGCACAGCTCAGCACTGC-3;反義鏈5-TCAGTTTCGTATCTTCATTGTC-3。β-actin正義鏈5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3';反義鏈5'-TCCTTAATGTCACGCAGATTT-3'。

1.4 免疫組化法檢測HLA-G、IL-10蛋白表達 免疫組化反應中所用的抗體:抗人HLA-G單克隆抗體4H84(Santa Cruz，USA)，兔抗人IL-10多克隆抗體(BOSTER，CHINA)。以IL-10和HLA-G的染色陽性細胞數占細胞總數的百分比作為其標記指數。至少在4個視野進行細胞計數(200倍顯微鏡視野下)。

1.5 統(tǒng)計學分析 運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)資料用x±s表示，定性資料的統(tǒng)計用fisher精確概率法;定量資料的統(tǒng)計用t檢驗或方差分析，兩因素相關性分析用Spearman等級相關。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌和正常肺組織中HLA-G、IL-10蛋白的表達38例肺癌標本中有21例(55.3%)HLA-G蛋白表達陽性，有23例(60.5%)IL-10表達陽性。而正常肺組織中沒有檢測到HLA-G和IL-10的蛋白表達。見圖1。

圖1 HLA-G和IL-10蛋白在肺癌組織中的表達(×200)

2.2 非小細胞肺癌和正常肺組織中HLA-G、IL-10 mRNA的表達 正常肺組織標本，均無HLA-G和IL-10 mRNA的表達。肺癌組織中HLA-G和IL-10 mRNA的表達量(2-△△Ct)分別是正常組織的 12.3倍(12.26±7.84，t=4.51，P＜0.01)和11.7倍(11.66 ±4.79，t=6.98，P ＜0.01)。

2.3 非小細胞肺癌中HLA-G和IL-10表達之間的關系 21例HLA-G蛋白表達陽性的肺癌標本中，有12例IL-10表達陽性，9例IL-10表達陰性，Spearman相關分析示，兩者在蛋白表達水平無明顯相關(r=－0.077，P=0.646)。兩者在mRNA水平也沒有明顯相關性(r=0.006，P=0.969)。

2.4 HLA-G與患者臨床病理因素的相關性 非小細胞肺癌HLA-G mRNA和蛋白表達均與肺癌TNM分期成正相關(r=0.913，P ＜0.001;r=0.429，P=0.007)，晚期非小細胞肺癌HLA-G的表達是增高的。除此之外，未發(fā)現(xiàn)其他臨床病理因素與HLA-G的表達相關。見表1。

表1 HLA-G mRNA和蛋白表達水平與肺癌患者臨床病理因素之間的關系

3 討論

雖然在腫瘤患者中，Th2細胞因子(IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)與腫瘤發(fā)展之間的臨床關系未被完全闡釋清楚，但目前認為機體抗腫瘤免疫系統(tǒng)的損害與細胞因子平衡向Th2方向系統(tǒng)性轉移有關。IL-10作為一種重要的Th2類細胞因子，可表達于不同腫瘤細胞中〔10〕。此外，IL-10作為一種重要的免疫抑制因子，其在創(chuàng)造有助于腫瘤生存的免疫抑制微環(huán)境中發(fā)揮著多種生物學效應。Moreau等人研究結果顯示，在單核細胞中IL-10誘導HLA-G的表達可能起著下調免疫反應的作用〔8〕。同時Singer等也發(fā)現(xiàn)IL-10陽性細胞經常位于HLA-G陽性細胞周圍，HLA-G可能誘導了IL-10的表達〔4〕。先前也有研究表明，HLA-G能調節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡朝Th2方向偏移，HLA-G被認為具有免疫調節(jié)作用〔11〕。由此推測，在腫瘤的發(fā)展過程中，HLA-G和IL-10可能通過相互調節(jié)而促進惡性腫瘤的轉移。

本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA和蛋白水平HLA-G的表達與IL-10無相關性。由此推測，IL-10的表達可能是膜型HLA-G及其他多種因素共同作用的結果。已有相關研究顯示，無論是否有膜型HLA-G表達細胞的存在，可溶性HLA-G都可通過單個核細胞從另一方面增加 IL-10的產物〔12〕，且釋放入血的可溶性HLA-G可通過誘導T細胞凋亡〔13〕或誘導IL-10的產生〔14〕促使系統(tǒng)免疫無應答。所以肺癌中可溶性HLA-G與IL-10的關系有待進一步研究。此外，分析表明HLA-G mRNA和蛋白表達均與肺癌TNM分期呈正相關。晚期肺癌患者腫瘤細胞中HLA-G的表達較早期患者增高。這一結果提示，HLA-G可能在肺癌進展中起重要作用，并可能成為評估肺癌預后的指標。

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