結(jié)直腸癌和息肉中Caspase通路上基因表達(dá)水平

潘益峰，張明五，金明娟，張善春，陳 坤，李其龍，馬新源，姚開顏，余運賢

(1.浙江大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，浙江 杭州 310058;2.浙江省嘉善縣腫瘤防治所，浙江 嘉善 314100)

結(jié)直腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，近年來發(fā)病率以每年4.71%的速度遞增，每年新增病例已經(jīng)超過17萬。根據(jù)中國國家癌癥數(shù)據(jù)庫資料顯示，在1991年－2005年期間結(jié)直腸癌是中國人群中發(fā)病率上升速度最快的三大惡性腫瘤之一［1］。許多研究已證明，結(jié)直腸息肉與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，結(jié)直腸息肉具有一定癌變傾向，尤其是腺瘤性息肉。

研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個十分復(fù)雜的、涉及多個因素參與的過程，不僅和細(xì)胞過度增生有關(guān)，也和細(xì)胞凋亡減少密切相關(guān)。Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，目前發(fā)現(xiàn)［2］，該家族至少有14種Caspase在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，根據(jù)其功能不同，可分為三類，第一類為凋亡始動子，包括 Caspase-2、-8、-9、和-10等，能在其它蛋白參與下發(fā)生自我活化并激活下游Caspase。第二類為凋亡效應(yīng)子，包括Caspase-3、-6和-7，能被上游的始動子激活，激活后作用于特異性底物使細(xì)胞發(fā)生分化及形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。第三類包括Caspase-1、-4、-5和-13等，主要參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中起輔助作用。近年來，國內(nèi)外做了大量有關(guān)Caspase表達(dá)與癌癥發(fā)生的研究，發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤細(xì)胞中，同一Caspases基因的表達(dá)變化并不一致，而且即使在同一腫瘤細(xì)胞中也存在不同Caspases基因的表達(dá)。Caspase-3在結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、胃癌等［3-5］多種腫瘤組織中的表達(dá)是明顯降低的;而在乳腺癌組織中呈過表達(dá)狀態(tài)［6］。本研究以結(jié)直腸癌高發(fā)區(qū)浙江省嘉善縣作為研究現(xiàn)場，利用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，檢測結(jié)直腸正常黏膜-結(jié)直腸息肉-結(jié)直腸癌序列中Caspases凋亡通路上相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，旨在探索其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本研究以在浙江省嘉善縣腫瘤所就診并進(jìn)行結(jié)腸直腸鏡檢查者為研究對象。采用病例對照研究設(shè)計，結(jié)直腸癌及息肉均經(jīng)病理組織確診;正常對照則來源于在腫瘤所進(jìn)行結(jié)腸或直腸鏡檢測的非結(jié)腸或直腸疾患者。在2008年－2010年期間，收集了結(jié)直腸癌組織19例、結(jié)直腸息肉組織86例及正常結(jié)直腸黏膜10例。通過問卷調(diào)查方式收集了研究對象的基本人口學(xué)特征(年齡、性別、職業(yè)和文化水平)、吸煙和飲酒等相關(guān)資料。

1.2 mRNA 檢測方法

1.2.1 RNA分離純化 采用 Trizol(Invetrogen)試劑盒分離純化組織中的總RNA，具體流程參考試劑說明書，采用核酸定量儀檢測總RNA的濃度和純度。

1.2.2 cDNA的合成 取2～5 μg總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系:2×RT Enzyme mix 10 μl，Oligo dT 引物1.0 μl，最后用RNAse free 水將反應(yīng)體系調(diào)整至20 μl;反應(yīng)條件:37℃、60 min，5℃、5 min，結(jié)束后凍存于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實時熒光定量 PCR檢測目的基因mRNA的表達(dá)水平 采用SYBR Green熒光實時定量PCR試劑盒檢測目的基因和內(nèi)參的擴(kuò)增曲線。PCR的反應(yīng)體系:SYBR Premix 5 μl，上下游引物各 1 μl(10 μmol/L)，cDNA 0.8 μl，用雙蒸水將體系調(diào)整至10 μl，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。在相同的條件下(模板及反應(yīng)條件)擴(kuò)增Caspase基因和內(nèi)參片段，分析其擴(kuò)增曲線，得到各個目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，并對Ct值進(jìn)行初步的處理和分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換 根據(jù)熒光定量PCR檢測的原理和本研究的設(shè)計方法對得到的Ct值進(jìn)行如下處理，目的基因的表達(dá)水平:特異性cDNA 的含量 =2－(Ctbeta-actin-Ct目的基因)。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。研究對象的人口學(xué)特征描述及比較:分類變量采用χ2檢驗，連續(xù)變量3組樣本間比較用方差分析;mRNA表達(dá)水平在3組間差異比較用方差分析和多元線性回歸。由于各Caspases基因的mRNA表達(dá)水平非正態(tài)分布，故做對數(shù)轉(zhuǎn)換(Ln)。采用多元線性回歸分析Caspases基因的mRNA表達(dá)水平在3組間差異時，調(diào)整的協(xié)變量包括研究對象的基本人口學(xué)特征(年齡、性別、職業(yè)和文化水平等)、吸煙和飲酒。各基因mRNA表達(dá)水平間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05作為統(tǒng)計學(xué)有顯著性水平的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌、息肉及正常黏膜組的基本人口學(xué)特征分布 本研究共收集19例結(jié)直腸癌組織(結(jié)直腸癌10例，直腸癌9例)，86例息肉組織和10例正常結(jié)直腸黏膜組織，其中男性72例，女性43例。結(jié)直腸組、息肉組及正常對照組的年齡、性別、組織部位、職業(yè)、吸煙和喝酒在各組間分布均衡(表1)。

2.2 結(jié)直腸癌、息肉及正常黏膜組中Caspase通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平比較 凋亡通路基因包括凋亡始動子Caspase-2、-8、-9、-10和凋亡效應(yīng)子Caspase-3、-6、-7，單因素方差分析及多因素線性回歸分析結(jié)果表明，各Caspase mRNA在結(jié)直腸癌、息肉及正常黏膜組織中的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(P＞0.05)。經(jīng)多因素校正之后，發(fā)現(xiàn)與正常黏膜組相比，Caspase-2、-6、-7、-8、-9 和-10 基因 mRNA 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平減少，而Caspase-3則在結(jié)直腸癌表達(dá)水平增加，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。盡管Caspase基因的表達(dá)水平3組間在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異，但是，從表2看還是存在表達(dá)差異的趨勢，其中 Caspase-2、-6、-9和-10 基因mRNA在3種組織中的表達(dá)水平由高到低，依次為正常組織、結(jié)直腸癌組織、息肉組織;Caspase-3基因mRNA表達(dá)水平則是在癌組織中最高，息肉組織中最低;Caspase-7的表達(dá)水平由高到低依次為對照組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織;Caspase-8的表達(dá)水平則是在癌組織中最低，而在息肉中最高。多因素線性回歸分析結(jié)果表明，Caspase-3、-6、-7和-9基因 mRNA 表達(dá)水平在3組的分布未發(fā)生改變;Caspase-2、-8和-10基因mRNA表達(dá)水平則發(fā)生了改變:經(jīng)校正后結(jié)直腸癌表達(dá)最低(表3)。

表1 結(jié)直腸癌組、息肉組及正常黏膜組織組的基本人口學(xué)特征分布Table 1 The distribution of socio－demographic characteristics in the three groups

表2 結(jié)直腸癌組、息肉組及正常黏膜組中各Caspase基因mRNA的表達(dá)(Ln)Table 2 The mRNA expression(Ln)of caspase apoptosis pathway genes in the three groups()

表2 結(jié)直腸癌組、息肉組及正常黏膜組中各Caspase基因mRNA的表達(dá)(Ln)Table 2 The mRNA expression(Ln)of caspase apoptosis pathway genes in the three groups()

基因 對照組(n=10)息肉組(n=86)結(jié)直腸癌組(n=19)P±2.783 0.7944 Caspase-3 －0.003 ±1.425 －0.383 ±2.068 0.196 ±2.862 0.5542 Caspase-6 7.172 ±3.278 5.471 ±3.757 6.039 ±4.281 0.3818 Caspase-7 0.469 ±2.335 －0.627 ±2.091 －0.678 ±2.516 0.3149 Caspase-8 －1.072 ±1.882 －1.069 ±1.983 －1.327 ±1.862 0.8896 Caspase-9 －5.605 ±1.715 －6.751 ±3.059 －6.651 ±2.815 0.5087 Caspase-10 －0.788 ±2.464 －1.975 ±2.478 －1.90 Caspase-2 －0.634 ±2.546 －1.247 ±2.702 －1.1905 ±2.566 0.3655

表3 各Caspase基因mRNA表達(dá)(Ln)多元線性回歸分析Table 3 The associations of polypus and colorectal cancer with caspase pathway genes mRNA(Ln)

2.3 各Caspase基因mRNA表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果 分別在正常黏膜對照組、息肉組及結(jié)直腸癌組對各Caspase基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行兩兩相關(guān)分析，結(jié)果表明:在息肉組和結(jié)直腸癌組中 Caspase-2、-3、-6、-7、-8 和-10 之間存在高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.7，并且均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001)，而 Caspase-9與其它Caspase通路相關(guān)基因均無相關(guān)(除在息肉組中Caspase-9與 Caspase-6之間存在弱相關(guān) r=0.229，P=0.0442)。而在正常黏膜對照組未發(fā)現(xiàn)這一趨勢(表4～表6)。

表4 各Caspase基因mRNA表達(dá)(Ln)在正常對照組的相關(guān)性分析Table 4 The analysis of correlations of caspase apoptosis pathway genes mRNA(Ln)in normal control group

表5 各Caspase基因mRNA表達(dá)(Ln)在息肉組的相關(guān)性分析Table 5 The analysis of correlations of caspase apoptosis pathway genes mRNA(Ln)in polypus group

表6 各Caspase基因mRNA表達(dá)(Ln)在癌癥組的相關(guān)性分析Table 6 The analysis of correlations of caspase apoptosis pathway genes mRNA(Ln)in colorectal cancer group

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Caspase凋亡通路基因的表達(dá)水平在正常腸黏膜、結(jié)直腸癌和息肉組織中的沒有顯著性的差異，但是除Caspase-9外，發(fā)現(xiàn)其它選擇的Caspase基因在腫瘤組織的表達(dá)水平呈顯著的高強度兩兩正相關(guān)關(guān)系。

腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞過度增殖有關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Caspase蛋白酶解級聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展中起關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者［7］。Caspase-8和-10是死亡受體介導(dǎo)通路(外在通路)的凋亡始動子，兩者所起的作用相似，均能激活下游Caspase，它們在染色體上定位于2q33-34，可能是來自同一祖先基因的復(fù)制子［8］。本研究未發(fā)現(xiàn)Caspase-8和-10的mRNA表達(dá)水平在結(jié)直腸癌組織與正常對照組織中存在顯著差異。一項免疫組化研究顯示:結(jié)腸癌細(xì)胞中Caspase-8蛋白水平與正常對照組比較沒有明顯差異［9］;Xu 等［10］的研究也發(fā)現(xiàn)，Caspase-8的mRNA表達(dá)水平與正常的直腸黏膜組織比較沒有明顯差異。但是，在直腸腺瘤和直腸癌組織中Caspase-10的mRNA表達(dá)水平均下降，這與本研究的結(jié)果不一致。Caspase-9是線粒體介導(dǎo)通路(內(nèi)在通路)的凋亡始動子，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。在胚胎形成過程中，Caspase-9表達(dá)缺失的老鼠，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在明顯的凋亡缺陷。本研究檢測了3種結(jié)直腸組織中的Caspase-9基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)存在顯著性差異。但有研究顯示［9］，結(jié)腸癌細(xì)胞中Caspase-9蛋白表達(dá)水平明顯下降。Caspase-3、-6和-7是凋亡內(nèi)在通路及外在通路共同的效應(yīng)子，其中Caspase-3是最重要的凋亡效應(yīng)子。同樣，本研究也未發(fā)現(xiàn)這3個基因的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌組織與正常對照組織中存在差異。

從DNA-mRNA-蛋白質(zhì)過程中存在三個層次的調(diào)節(jié)，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，翻譯水平調(diào)控和翻譯后水平調(diào)控。本研究未發(fā)現(xiàn)Caspase-凋亡通路基因mRNA的表達(dá)在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)生顯著變化，一方面可能是Caspase基因mRNA翻譯水平的調(diào)控，即對mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行的選擇性剪接，導(dǎo)致 Caspase蛋白功能發(fā)生改變［11］。蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生理和病理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)表達(dá)水平和功能的研究將直接闡明其在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的作用。從mRNA角度考慮，實際上只是從轉(zhuǎn)錄水平方面進(jìn)行探討，并不能完全代表蛋白表達(dá)水平。而且蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等幾乎無法從mRNA水平來判斷。本研究未能發(fā)現(xiàn)Caspase凋亡通路基因的表達(dá)水平在正常腸黏膜、結(jié)直腸癌和息肉組織中存在差異，或許mRNA水平不一定體現(xiàn)得出差異，以后的研究有必要同時檢測 Caspase凋亡通路的 mRNA表達(dá)水平、Caspases酶原形式及活化型蛋白的表達(dá)水平，來共同探討Caspase凋亡通路基因是通過哪個環(huán)節(jié)影響結(jié)直腸癌的形成的。

此外，本研究還做了Caspases凋亡通路各基因mRNA表達(dá)之間的相關(guān)分析，結(jié)果表明，大部分上下游Caspases基因mRNA的表達(dá)在腫瘤組織中存在強正相關(guān)，而在息肉和正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)關(guān)系，提示各Caspases基因在腫瘤的發(fā)生過程中相互作用，相互促進(jìn)。體外實驗也表明，Caspase-10能夠激活下游凋亡效應(yīng)子 Caspase-3和-7［10］。因此，從機(jī)制學(xué)角度也能說明上下游Caspases基因mRNA的表達(dá)存在正相關(guān)。Wang等［12］報告 Caspase-8和Caspase-10能夠彼此交叉抑制，在死亡受體通路中緊密相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)在正常對照組中Caspase-9與Caspase-3基因mRNA的表達(dá)呈高度正相關(guān)，而在息肉組和癌癥組均未發(fā)現(xiàn)此相關(guān)，但Caspase-9基因與Caspase通路其它相關(guān)基因表達(dá)水平間均不相關(guān)。Caspase-9是內(nèi)在凋亡通路的重要的始動子，而Caspase-3則是兩條通路最重要的共同效應(yīng)子，以上結(jié)果提示在結(jié)直腸癌形成過程中，可能兩條凋亡相關(guān)通路所起的作用不同，以Caspase-8為始動子的受體介導(dǎo)的通路(外在通路)可能在結(jié)直腸癌致癌過程中起到主要作用。有關(guān)Caspases凋亡通路各基因與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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