馬勃菌絲體碳氮源利用的研究

孔 超 王麗華 宋愛榮

(山東省應(yīng)用真菌重點實驗室,青島農(nóng)業(yè)大學藥用真菌研究所,青島 266109)

馬勃 (puff-ball),俗稱牛屎菇或馬蹄包,隸屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)、腹菌綱 (Gasteromycetes)、馬勃目(Lycoperdales)、馬勃科。馬勃種類繁多,分布廣泛,在世界上大部分地區(qū)都有分布的記載。中國藥典 (2005年版)[1]收載的馬勃主要為脫皮馬勃 (Lasiosphoera fenzlii Reich),大馬勃[Calvatia gigantean(Batsch)Lloy]或紫色馬勃 [C.lilacina(Mont.et Berk.)Lloyd]的干燥子實體。此外還有黃硬皮馬勃、光硬皮馬勃和地形科、灰包科等數(shù)10種馬勃民間作為藥用。

馬勃為食藥兼用真菌,最早記載于 《名醫(yī)別錄》,味辛性平,入肺經(jīng),有消腫、止血、解毒等功效,用于消除咽喉腫痛及各種出血癥。李時珍的《本草綱目》中記載:“凡用以生布張開,將馬勃于上摩擦,下以盤承取末利用”。原為野生,現(xiàn)可進行人工馴化栽培。

馬勃的化學成分包括甾體化合物[2]、萜類化合物[3]、小分子含氮化合物、馬勃多糖[4]、蛋白質(zhì)、肽類、生物堿[5]等。馬勃含有各種氨基酸[6],人體必需的8種氨基酸含量較高,特別富含賴氨酸、蛋氨酸,還含有馬勃素、無機鹽和微量元素等。

現(xiàn)代醫(yī)學驗證,馬勃具有一定的藥理作用和臨床應(yīng)用價值。馬勃入藥部位為子實體,相關(guān)的藥理研究主要有以下幾個方面:抑菌作用[7]、抗炎作用[8]、止咳作用[9]、止血作用[10]、殺蟲作用[11]、抗腫瘤細胞作用[12]、抗增殖[13]和抗細胞分裂活性[14]、變態(tài)反應(yīng)[15]、抗氧化作用[16]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 馬勃464菌株,山東省應(yīng)用真菌重點實驗室保存。

1.2 供試培養(yǎng)基 母種培養(yǎng)基 (馬鈴薯加富培養(yǎng)基):馬鈴薯20%、麩皮1%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、瓊脂 2%、水1L。

碳源培養(yǎng)基:馬勃菌平板培養(yǎng)的碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為蔗糖2%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、瓊脂2%、蒸餾水300 mL,pH自然。分別用葡萄糖、半乳糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、玉米面、玉米淀粉、地瓜淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉替換碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖,以不加碳源的培養(yǎng)基為對照。

氮源培養(yǎng)基:馬勃菌平板培養(yǎng)的氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為 (NH4)2SO40.5%、蔗糖 2%、KH2PO4 0.05%、MgSO40.05%、瓊脂2%、蒸餾水300 mL,pH 自 然。 分 別 用 NH4NO3、NaNO3、NH4Cl、NH4HCO3、NH4H2PO4、豆粉、麩皮、蛋白胨、尿素、玉米粉替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的 (NH4)2SO4,以不加氮源的培養(yǎng)基為對照。

1.3 試驗方法 馬勃菌固體平板培養(yǎng)法:按照無菌操作要求,挑取活化的菌種塊約0.5 cm2接種于固體平板中央,封口標記。各處理設(shè)10個重復,采用內(nèi)徑為12mm的打孔器定量取種,在平板中心接種,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光靜置培養(yǎng)。從接種塊萌發(fā)時開始記錄,待菌絲長出原菌塊后,每天采用 “十字交叉法”測量菌落直徑,觀察菌絲生長情況并記錄菌落特征。待處理組的菌絲體長滿平板直徑時,結(jié)束該處理組培養(yǎng)。記錄培養(yǎng)天數(shù)、菌絲生長情況等,并進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬勃菌碳源利用的平板篩選

(1)不同碳源對馬勃菌絲體日均生長量的效應(yīng)。從表1可以看出,3號以甘露醇為碳源的處理,對馬勃菌絲體日均生長量的效應(yīng)明顯,日均生長量為1.344 cm;其次是1號以玉米面為碳源的處理,日均生長量為1.310 cm;9號以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基對馬勃菌絲體生長效應(yīng)不明顯,日均生長量僅為0.292 cm。12號不加碳源為對照,盡管日均生長量較大,為1.362 cm/天,但是菌絲體長勢較差,表現(xiàn)為菌絲稀疏,灰白色,緊貼培養(yǎng)基。

從表1可以看出,可溶性淀粉培養(yǎng)基與其余碳源培養(yǎng)基存在極顯著差異 (1%水平),其他各處理間差異不顯著。

(2)不同碳源對馬勃菌絲體長勢的影響。從表1可以看出,以玉米面、甘露醇作為碳源的處理1、3,菌絲長勢好;測量結(jié)束幾天后繼續(xù)觀察,甘露醇菌絲體長勢顯著優(yōu)于玉米面,表現(xiàn)為白色致密,絨氈狀,鋪滿整個平板;其次為以馬鈴薯淀粉、地瓜淀粉、乳糖為碳源的處理6、7、8;可溶性淀粉作為碳源的處理9馬勃菌絲體不生長。

表1 不同碳源的馬勃菌絲體日均生長量及菌絲生長情況

在碳源試驗中,以菌絲長滿平板直徑為標準,結(jié)束平板培養(yǎng)。觀察各處理的菌落形態(tài),其中,以麥芽糖、甘露醇處理的菌絲首先長滿培養(yǎng)皿。

值得一提的是,本試驗碳源培養(yǎng)基以蛋白胨作為氮源[17],因蛋白胨為復雜的天然有機物質(zhì),其中可能含有可充當碳源的營養(yǎng)成分,因此沒有添加其他碳源的空白對照組菌絲體生長雖然稀疏,但仍較快。綜合分析菌體生長速度和菌落形態(tài),馬勃菌絲體的單因子碳源試驗結(jié)果以甘露醇為最佳。

2.2 馬勃菌氮源利用的平板篩選

(1)不同氮源對馬勃菌絲體日平均生長量的效應(yīng)。從表2可以看出,11號以麩皮為氮源的處理,對馬勃菌絲體日均生長量的效應(yīng)較大,日均生長量為1.80625 cm;其次為12號以豆粉為氮源的處理、4號以NaNO3為氮源的處理,日均生長量分別為1.7375 cm、1.6975 cm;而5號以NH4Cl為氮源的處理及1號以 (NH4)2SO4為氮源的處理對馬勃菌絲體日均生長量的效應(yīng)較小,日均生長量分別為0.41735 cm、0.39625 cm。13號不加氮源為對照,盡管日均生長量 (1.70313 cm)較大,但是菌絲體長勢較差,表現(xiàn)為菌絲體稀疏,白色,緊貼培養(yǎng)基。

各處理經(jīng)差異顯著性分析結(jié)果 (表2),以(NH4)2SO4作氮源的處理1與其他各處理存在顯著差異。

表2 不同氮源的馬勃菌絲體日均生長量及菌絲生長情況

(2)不同氮源對馬勃菌絲體生長的效應(yīng)。從表2看出,以NaNO3、尿素為氮源的處理,馬勃菌絲體生長情況較好。當測量結(jié)束,繼續(xù)培養(yǎng)2天后觀察,發(fā)現(xiàn)后期NaNO3培養(yǎng)基菌絲體白色致密,絨氈狀,鋪滿整個平板;尿素為氮源的,表現(xiàn)為菌絲稀疏,并漸變?yōu)榛野咨Ｆ溆嗟磁囵B(yǎng)基仍表現(xiàn)為生長緩慢,菌絲顏色與前期沒有多大區(qū)別。

在氮源試驗中,以菌絲長滿平板直徑為標準,結(jié)束平板培養(yǎng)。觀察各處理的菌落形態(tài),其中,以尿素、NaNO3處理的菌絲首先長滿培養(yǎng)皿。

馬勃平板培養(yǎng)特性氮源的選擇試驗結(jié)果顯示,馬勃菌絲體以NaNO3作為氮源生長得最好。差異顯著性分析的結(jié)果顯示,麩皮、豆粉、對照、NaNO3、玉米粉 、尿素 、蛋白胨 、NH4Cl、NH4HCO3、NH4NO3、酵母膏、NH4H2PO4、NH4Cl與(NH4)2SO4之間存在顯著差異(5%水平);但各處理間無極顯著差異(1%水平)。

3 討論

根據(jù)本試驗結(jié)果,馬勃464菌株菌絲體生長的最佳碳源為甘露醇,最佳氮源為NaNO3。在試驗過程中,由于對接種菌齡一致性、接種時菌塊大小一致性和菌種接種部位的確定性等方面還會存在一些問題,難免會影響試驗結(jié)果的準確性。本研究是在單因子條件下測試的碳、氮營養(yǎng)[18],而多因子的交互效應(yīng)尚需進一步進行研究;試驗方案設(shè)計的系統(tǒng)性也有待于進一步提高。

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