響應(yīng)面法優(yōu)化不同蛋白酶制備麥麩膳食纖維

黃紀(jì)念，王長虹，2，孫 強(qiáng)，宋國輝，蘆 鑫，張麗霞

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

膳食纖維是一種被稱為“第七營養(yǎng)素”［1］，不能被人體消化吸收的多糖，但對人體具有十分重要的生理功能。研究表明，膳食纖維通過調(diào)節(jié)體內(nèi)碳水化合物和脂質(zhì)的代謝，影響礦物質(zhì)的吸收，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，增進(jìn)腸道內(nèi)有益菌群增殖等生理作用［2］。因此，它對腸癌、便秘、肥胖病、糖尿病、心血管疾病等慢性疾病有一定的預(yù)防和治療作用［3-5］。

麥麩是面粉加工的主要副產(chǎn)品，含有35%～50%的膳食纖維［6］，其中的纖維素和半纖維素，是優(yōu)質(zhì)的膳食纖維來源［7-8］。目前，麥麩膳食纖維制備方法主要有化學(xué)法、酶法、酶-化學(xué)法［9-12］。化學(xué)法制得的膳食纖維純度較高，但色澤深、不易漂白;產(chǎn)品堿味重、口感不佳［6］，且加工條件較為苛刻，儀器設(shè)備要求高，并污染環(huán)境。酶-化學(xué)法制備膳食纖維中也需加入酸、堿、鹽等，會(huì)造成鹽殘留，從而影響膳食纖維的適口性與安全性。酶法制備的膳食纖維品質(zhì)較酶-化學(xué)法高，色澤淺，易漂白，無異味，條件溫和，對環(huán)境污染小。因此，我們采用酶法從麥麩中提取膳食纖維，通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件，并比較不同蛋白酶對麥麩膳食纖維純度的影響?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥麩皮。鄭州市面粉廠提供，原料麥麩組成成分為水分6.81%，總膳食纖維47.31%，脂肪2.16%，不溶性膳食纖維 45.30%，蛋白質(zhì)15.78%，水溶性膳食纖維2.01%，淀粉19.14%，灰分4.86%。

中溫 a-淀粉酶(4 000 U·g-1)、風(fēng)味蛋白酶(20 000 U·g-1)和胰蛋白酶 (250 000 U·g-1)由GIBCO公司提供;糖化酶(100 000 U·g-1)和堿性蛋白酶 (200 000 U·g-1)Solarbio公司提供。

主要儀器與設(shè)備。UV-2800紫外分光光度計(jì)，上海尤尼柯公司;XMTA-608電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海佳盛有限公司;Anke DL-5-B低速大容量離，上海安亭公司;HH-S恒溫水浴鍋，上海博迅公司;KS-600EI超聲波清洗機(jī)，寧波海曙科生公司;ZDDN-Ⅱ全自動(dòng)凱氏定氮儀，杭州托普有限公司;XS205分析天平，上海梅特勒-托利多公司;KLUP-IV-10艾柯超純水機(jī)，臺(tái)灣艾柯公司等。

1.2 麥麩膳食纖維制備工藝流程

1.2.1 原料預(yù)處理

過篩水洗麥麩:按原料麥麩與水1∶10(m∶m)配置浸泡30 min，然后過孔徑0.125 mm(120目)的篩，水洗至澄清，以除去麩皮表面部分淀粉及其他雜質(zhì)［13］。

分解植酸:取上述麥麩與水以1∶10(m∶V)的比例混合，用濃H2SO4調(diào)pH值至5.0～5.5，保持50～60℃，充分?jǐn)嚢?10 h，用清水漂洗至中性［14］。

脫除脂肪:將上述濕麥麩加4倍于體積的無水乙醇并浸泡3 h，水洗至中性［15］，然后置于鼓風(fēng)干燥箱，60℃烘干。

酶水解淀粉:取上述麥麩10.000 g(干基)，加入100 mL的水，55℃下，用100 g·L-1的檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，同時(shí)加入4%(m∶m)的淀粉酶 (中溫 α-淀粉酶∶糖化酶為1∶3，m∶m)，恒溫?cái)嚢?.5 h，沸水浴15 min滅酶。

1.2.2 酶解麥麩蛋白

將上述反應(yīng)體系保持至設(shè)定溫度，用2.0 mol·L-1的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到設(shè)定值，再加入一定量的蛋白酶，酶解麥麩蛋白。酶解結(jié)束后，沸水浴15 min滅酶。然后冷卻、水洗酶解剩余物至中性，60℃干燥24 h，得到麥麩膳食纖維。

1.3 麥麩基本成分測定

水分含量測定，直接干燥法 (GB/T5009.3.2003);蛋白質(zhì)含量測定，凱氏定氮法(GB/T5009.5.2003);脂肪含量測定，索氏抽提法(GB/T5009.6.2003);灰分含量測定，直接灰化法(GB/T5009.4.2003);淀粉含量測定，酶水解法(GB/T5009.9.2003);膳食纖維含量測定，酶重量法(GB/T22224.2008)。

1.4 水解度測定

蛋白質(zhì)水解度 (DH):采用pH-State法。

DH(%)=游離氨基態(tài)氮 (g)/總氮 (g)×100。

1.5 膳食纖維純度測定

膳食纖維純度測定 (%)=酶解后麥麩中總膳食纖維質(zhì)量 (g)/酶解后的麥麩質(zhì)量 (g)×100。

1.6 響應(yīng)曲面 (RSM)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，對工藝條件進(jìn)一步研究，以獲得最佳工藝參數(shù)。

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Design Expert 7.1.2處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為顯著，P＜0.01極顯著。無特殊說明，所有實(shí)驗(yàn)平行測定3次，結(jié)果均為平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同因素對蛋白酶酶解效果的影響

從酶解蛋白過程考慮，分別了解酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度以及酶用量對麥麩蛋白水解度的影響，確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平，從而探討最佳工藝條件。

2.1.1 時(shí)間

取麥麩10.000 g(干基)將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶反應(yīng)體系的pH值分別控制為8.5，7.5和 7.0，加酶量分別為 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解溫度分別為60℃，55℃和55℃的條件下，研究時(shí)間對3種蛋白酶酶解麥麩蛋白水解的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 時(shí)間對蛋白酶酶解效果的影響

從圖1可以看出，酶解時(shí)間從0.5 h到2.0 h時(shí)，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶水解度快速增加，2.0 h之后水解度增加緩慢，而堿性蛋白酶酶解時(shí)間從0.5 h到3.0 h時(shí)，水解度增加比較明顯，3.0 h以后增加緩慢。這可能與酶解反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后，蛋白酶酶解作用位點(diǎn)數(shù)目所剩很少，再延長酶解時(shí)間，水解度增加并不明顯有關(guān)。因此分別選擇3.0，2.0，2.0 h作為其他單因素實(shí)驗(yàn)的因素水平。2.1.2 溫度

取麥麩10.000 g(干基)將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶反應(yīng)體系pH值分別控制為8.5，7.5和 7.0，加酶量分別為 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解時(shí)間分別為3.0，2.0，2.0 h條件下，研究溫度對3種蛋白酶酶解麥麩蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，溫度從45℃變化到55℃時(shí)，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶對麥麩蛋白的水解度隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度為55℃時(shí)，水解度達(dá)到最大，超過55℃麥麩蛋白水解度呈下降趨勢;對于堿性蛋白酶，溫度從45℃變化到60℃時(shí)麥麩蛋白水解度隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，水解度達(dá)到最大，超過60℃麥麩蛋白水解度呈下降趨勢;因此分別選擇60℃，55℃，55℃作為堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶其他單因素的實(shí)驗(yàn)因素水平。

圖2 溫度對蛋白酶酶解效果的影響

2.1.3 pH值

取麥麩10.000 g(干基)將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶的酶解溫度分別控制為60℃，55℃，55℃，加酶量分別為 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解時(shí)間分別為3.0，2.0，2.0 h條件下研究 pH值對3種蛋白酶酶解麥麩蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH值對蛋白酶酶解效果的影響

從圖3可以看出，對堿性蛋白酶，pH值從8.0變化到9.0時(shí)，麥麩蛋白水解度隨著pH值的增大而增大，當(dāng) pH值為9.0時(shí)，水解度達(dá)到最大，超過9.0之后麥麩蛋白水解度呈下降趨勢;pH對胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶水解度的影響整體趨勢和堿性蛋白酶相似，但胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶對麥麩的最佳酶解 pH分別為7.5，7.0。因此取 p H為9.0，7.5，7.0分別作為其他單因素實(shí)驗(yàn)的因素水平。

2.1.4 加酶量

取麥麩10.000 g(干基)將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶的酶解溫度分別控制為60℃，55℃，55℃，酶解時(shí)間分別為3.0，2.0，2.0 h，酶解p H值分別為9.0，7.5，7.0條件下研究加酶量對3種蛋白酶蛋白酶酶解麥麩蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 加酶量對蛋白酶酶解效果的影響

從圖4可看出，堿性蛋白酶加酶量從200～1 000 U·mg-1蛋白時(shí)，麥麩蛋白的水解度快速增加，超過1 000 U·mg-1蛋白時(shí)麥麩蛋白水解度增加非常緩慢。胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶加酶量對麥麩蛋白水解度的影響整體趨勢與堿性蛋白酶相似，加酶量分別從 200～800 U·mg-1蛋白和 20～100 U·mg-1蛋白時(shí)，麥麩蛋白的水解度快速增加，超過800 U·mg-1蛋白和100 U·mg-1蛋白時(shí)麥麩蛋白水解度增加非常緩慢。這說明在底物濃度一定時(shí)，麥麩蛋白的水解效率取決于酶用量，酶用量越大，酶的催化位點(diǎn)與蛋白質(zhì)分子相應(yīng)位點(diǎn)接觸幾率越多，水解速度越快。

2.2 堿性蛋白酶酶解麥麩蛋白的條件優(yōu)化

從單因素實(shí)驗(yàn)可以看出，堿性蛋白酶水解麥麩蛋白過程中，加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和p H都對水解度有較大的影響。因此在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用Design Expert軟件，采用中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案［16-17］進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［18］，考察4個(gè)因素之間的相互作用對酶解反應(yīng)的影響 (表1)，確定堿性蛋白酶水解麥麩蛋白的最優(yōu)工藝條件。

Box-Behnken中心組合中，加酶量因素 (X1)水平為800，1 000，1 200 U·mg-1，其編碼值分別為-1，0，1;溫度因素 (X2)水平為55℃，60℃，65℃，其編碼值分別為-1，0，1;p H值因素 (X3)水平為8.5，9.0，9.5，其編碼值分別為-1，0，1;時(shí)間因素 (X4)水平為2.0，2.5，3.0 h，其編碼值分別為 -1，0，1。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

利用Design Expert軟件，對表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得麥麩蛋白水解度對加酶量、溫度、p H值、時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程:

從回歸方程的方差分析結(jié)果 (表2)可見，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型F值為14.30**，為極顯著;失擬項(xiàng)在P=0.05水平上不顯著，整個(gè)模型的R2為0.935，變異系數(shù)為3.153%。表明方程的因變量與全體自變量之間的回歸效果顯著，此回歸方程能解釋實(shí)際情況。

由回歸方程的各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，水解度方程的一次項(xiàng)顯著，各因素的交叉項(xiàng)相互作用不顯著，二次項(xiàng)極顯著，說明各個(gè)具體實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的一次線性關(guān)系，而是二次拋物面的關(guān)系。由于各個(gè)因素之間的交互作用在實(shí)驗(yàn)中基本上沒有什么影響。所以在以后的實(shí)驗(yàn)中可以不考慮各個(gè)因素之間的交互作用。

表2 回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果

由Design-Expert統(tǒng)計(jì)分析軟件作響應(yīng)曲面及等高線圖，分析加酶量、溫度、酶解時(shí)間對堿性蛋白酶水解度的影響 (圖5)。各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響趨勢可通過這組圖直接反應(yīng)出來。

從圖5中可以看出，各因素之間對模糊綜合評價(jià)值評價(jià)的影響有協(xié)同作用。加酶量X1對響應(yīng)值的影響最大，是水解度的最主要因素，表現(xiàn)為曲線較徒;酶解時(shí)間X4次之。因此選擇合適的加酶量和酶解時(shí)間，可獲得麥麩的較高水解度。在3個(gè)對水解度影響較大的因素中，從大到小依次為加酶量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度，即加酶量對水解度的影響最為顯著，酶解溫度相對影響不大。

圖5 加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間的響應(yīng)面

2.3 最佳實(shí)驗(yàn)條件確定

在所選各因素范圍內(nèi)，通過Design-expert7.0軟件建立模型分析，得出利用堿性蛋白酶提取麥麩膳食纖維的最佳工藝條件為加酶量1 136 U·mg-1蛋白，酶解溫度59.94℃，pH值8.91，酶解時(shí)間2.19 h，該條件下水解度預(yù)測值為24.02%。采用上述優(yōu)化條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的情況，將優(yōu)化溫度修正為60℃，結(jié)果麥麩膳食纖維水解度為 24.13%，麥麩膳食纖維純度為93.28%。

2.4 風(fēng)味蛋白和胰蛋白酶酶解麥麩蛋白的條件優(yōu)化

采用與前面堿性蛋白酶一樣的研究方法，分別改用風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶，研究加酶量、溫度、pH、時(shí)間對麥麩蛋白水解度的影響，并用響應(yīng)面法優(yōu)化這2種酶的最佳條件，比較堿性蛋白酶，胰蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶對麥麩蛋白水解度及膳食纖維純度的影響。胰蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶的實(shí)驗(yàn)因素水平及其編碼值如表3所示。

由表4可知，以水解度為指標(biāo)，堿性蛋白酶，胰蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶在響應(yīng)面優(yōu)化的條件下，對麥麩蛋白水解能力大小順序?yàn)閴A性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞胰蛋白酶;膳食纖維純度為堿性蛋白酶處理樣品＞風(fēng)味蛋白酶＞胰蛋白酶。

由表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，堿性蛋白酶，胰蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶都在相同酶活400 U·mg-1下，對麥麩蛋白的水解能力大小順序?yàn)閴A性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞胰蛋白酶。這可能由于堿性蛋白酶可以裂解Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和 Gln的羧基端及Ala、val、Try［19］，較胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解麥麩蛋白能力更強(qiáng)。從純度的角度來分析，3種酶中堿性蛋白酶為水解麥麩蛋白質(zhì)的最佳蛋白酶。這與國外采用的商業(yè)堿性蛋白酶作為水解蛋白酶的研究結(jié)果相一致［20］。

表3 胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶實(shí)驗(yàn)因素水平及其編碼值

表4 3種酶的酶解優(yōu)化條件及膳食纖維純度

表5 相同酶活下3種蛋白酶對麥麩蛋白水解度影響

3 小結(jié)

利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了堿性蛋白酶，胰蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶對麥麩蛋白的酶解工藝，堿性蛋白酶最佳酶解條件為加酶量1 136 U·mg-1，pH值8.91，酶解溫度59.94℃，酶解時(shí)間2.19 h，水解度達(dá)到24.13%，膳食纖維的純度為93.28%;胰蛋白酶最佳酶解條件為加酶量為1 345 U·mg-1，pH值為7.25，溫度為55.00℃，時(shí)間為 2.30 h，水解度達(dá)到11.22%，膳食纖維的純度為86.55%;風(fēng)味蛋白酶最佳酶解條件為加酶量為126 U·mg-1，pH為7.00，溫度56.80℃，時(shí)間2.80 h，水解度達(dá)到 4.87%，膳食纖維的純度為63.38%。

以水解度為指標(biāo)，在最優(yōu)條件下，堿性蛋白酶的水解能力遠(yuǎn)大于胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，其中以這3種酶得到的麥麩膳食纖維的純度，堿性蛋白酶也明顯優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶。因此堿性蛋白酶為酶解麥麩蛋白的最佳蛋白酶。

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