新生大鼠腦組織中線粒體的分離

劉 彤,李 哲,畢曉穎

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)教研室,吉林長春130021;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室)

線粒體是細(xì)胞的重要細(xì)胞器,它在細(xì)胞能量代謝、自由基生成、蛋白質(zhì)磷酸化,尤其是在細(xì)胞凋亡過程中起核心調(diào)控作用[1]。Science于1999年發(fā)表了“Mitochondrial make a comeback”專題系列論文[2],重申線粒體再度成為當(dāng)今生命科學(xué)和分子醫(yī)學(xué)中的熱點和前沿。線粒體功能缺陷可引起神經(jīng)肌肉疾病、心血管病、糖尿病、帕金森氏病和腫瘤學(xué)等多種疾病,分離線粒體對于我們理解線粒體功能障礙與相關(guān)疾病的機(jī)制有重要作用。但是,針對新生大鼠腦組織中線粒體的分離和特性分析的描述還不全面。因此,本實驗的目的就是建立一個方法,用來快速的對新生大鼠腦組織中的線粒體進(jìn)行分離,并為其特性分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 新生大鼠6只、超速離心機(jī)、電子顯微鏡、天平、動物手術(shù)器械、勻漿器

1.2 試劑 0.25M蔗糖、0.5 mM K+-EDTA、10 mM Tris-HCl、10mg/ml牛的血清白蛋白、用線粒體緩沖液稀釋的濃度分別為12%、26%、40%的Percoll、2.5%戊二醛、2%四氧化鋨、乙醇、丙烯氧化物、樹脂。

1.3 方法

1.3.1 線粒體的分離

(1)迅速摘取新生大鼠的腦,稱重400-500 mg,移入冰冷的線粒體分離緩沖液(0.25 M蔗糖,0.5 mM K+-EDTA 10mM Tris-HCl,pH=7.4)中 ,在實驗過程中所有的儀器和緩沖液都要保持冰冷(4℃),每個腦都分離出左右半球,并保證每個樣品中都含有左右腦組織。

(2)每個樣品在3.6 ml 12%的Percoll中攪勻,用直徑為0.12 mm的勻漿器攪拌10次,再用直徑為0.06 mm的勻漿器攪拌10次。

(3)在離心管中先鋪一層1.2 ml 40%的Percoll,再鋪一層1.2 ml 26%的Percoll,然后取上述攪拌好的樣品1.2 ml鋪在最上層。

(4)將離心管超速離心19 000轉(zhuǎn)5分鐘,棄去上清,取中層液體并將其1∶4稀釋在線粒體緩沖液中,再超速離心14 000轉(zhuǎn)10分鐘,將沉淀稀釋在1 ml線粒體緩沖液中,超速離心14 000轉(zhuǎn)5分鐘,最后將沉淀溶于100微升線粒體緩沖液中。

1.3.2 線粒體的電鏡觀察

(1)將管中一二三層的液體都固定在2.5%的戊二醛中,每個樣品用0.1 M的磷酸鹽緩沖液(150 mM磷酸氫二鈉,100mM氫氧化鈉,PH7.4)洗三次共十分鐘,然后在2%四氧化鋨中固定1小時。

(2)每個樣品再用0.1M的磷酸鹽緩沖液洗三次 ,在濃度分別為 25%、50%、85%、95%、100%的乙醇溶液中脫水十分鐘。

(3)每個樣品再在丙烯氧化物中深度脫水十分鐘,然后在1∶1的丙烯氧化物和樹脂混和物中滲透兩小時,然后在1:2的丙烯氧化物和樹脂混和物中過夜。

(4)最后將樣品包埋入樹脂中70℃過夜,電鏡觀察線粒體。

2 結(jié)果

2.1 線粒體的分離

Percoll密度梯度離心提供獲得高純度腦組織線粒體的最佳方法,Percoll密度梯度中的三種濃度的電鏡照片見圖1。在此研究中改變Percoll密度梯度條件可影響線立體的分離純度和產(chǎn)率。中層Percoll濃度在20%-24%時,超速離心后可以看見在中層(26%)和底層(40%)之間有一條很淺的帶。電子顯微鏡下觀察這一條帶含有除線立體外的其他細(xì)胞成分。在中層使用26%的Percoll可以去除這一層并使中層得到產(chǎn)率更高的線粒體。

2.2 線粒體的電鏡觀察

分離第二層線粒體超微結(jié)構(gòu)見圖2。利用上述方法分離出新生大鼠腦組織中的線粒體,電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)具有完整的線粒體外膜和發(fā)育良好的線粒體嵴,線粒體的密度很高且形狀不同,呈球形和橢圓形。在所有的線粒體樣品中,中層Percoll濃度在20%-24%時,觀察發(fā)現(xiàn)約有90%為線粒體。

圖1 不同濃度Percoll的線粒體分離圖

圖2 線粒體超微結(jié)構(gòu)

3 討論

線粒體是許多重金屬毒作用的靶細(xì)胞器,研究線粒體功能的改變對于探討重金屬對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用機(jī)制具有重要的意義。許多研究者已經(jīng)報道了從成人腦組織分離線粒體的不同方法,但是對新生兒腦組織中的線粒體分離方法卻描述甚少。

最初,我們曾用Ficoll梯度來分離線粒體,線粒體純度較低,后來,我們改用Percoll密度梯度離心法從新生腦組織中分離線粒體,結(jié)果獲得了高純度和產(chǎn)率的線粒體。本實驗從新生大鼠腦組織中分離線粒體,并對其特性做出了詳盡的分析和闡述。使用Percoll梯度法來分離新生大鼠腦組織中的線粒體是一種快速有效的方法[3-5],它可以得到純度和產(chǎn)率較高的線粒體。并通過電子顯微鏡對新生大鼠腦組織中的線粒體進(jìn)行形態(tài)觀察得以驗證。

在成年大鼠腦組織線粒體的制備中,大多數(shù)線粒體沉淀在了第三層(Percoll26%-40%)。在新生大鼠腦組織線粒體的制備中,使用相同的密度梯度離心,大多數(shù)線粒體沉淀在了第二層(Percoll12%-26%)。這個不同之處可能是因為沉淀系數(shù)不同以及成年大鼠和新生大鼠線粒體中細(xì)胞成分的密度不同所致。調(diào)整中層 Percoll的濃度,調(diào)為20%-24%,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第三層中的線粒體增多,而這一層含有除線粒體以外的其他細(xì)胞成分。本實驗顯示成年大鼠和新生大鼠腦組織中的線粒體有明顯的不同。

從新生大鼠腦組織中分離出的線粒體在電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其大小和形狀并不相同。絕大多數(shù)的線粒體很小(0.5-1微米),形狀有橢圓形和球形。此形態(tài)與成年大鼠腦組織中的線粒體的表現(xiàn)一致。但一些線粒體被破壞了,能夠看見其形態(tài)但是缺乏線粒體嵴。如果在腦組織攪拌過程中減少攪拌次數(shù)可以降低線粒體的破壞率,但是細(xì)胞破裂不完全使細(xì)胞沉淀在第二層。

綜上所述,這些結(jié)果顯示使用Percoll密度梯度離心的方法可以成功地從新生大鼠腦組織中分離出線粒體,為新生大鼠腦組織中線粒體功能研究提供一個實用的模型。

[1]Cassarino DS,Bennett JP.An evaluation of the role of mitochondria in neurodegenerative diseases:mitochondrial mutations and oxidative pathology,protective nuclear responses,and cell death in neurodegeneration,Brain Res[J].Brain Res Rev,1999,(29):1.

[2]Kibertis PA.Mitochondrial makes a comeback[J].Science,1999,283:1475.

[3]Truscott KN,Fanner NP.Import of carrier proteins into mitochondria[J].Biol Chem,1999,380:1151.

[4]Sims NR,Anderson MF.Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation[J].Nat Protoc,2008,3(7):1228.

[5]Dunkley PR,Jarvie PE,Robinson PJ.A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes[J].Nat Protoc,2008,3(11):1718.