雙孢蘑菇菌種液氮保種方法的研究*

李洪榮

（福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014）

菌種保藏的目的是保持菌種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的優(yōu)良性狀，盡量減少或降低菌種的衰退速度和死亡率，使菌種保證統(tǒng)一和不被污染，能夠長期或較長期地在生產(chǎn)中應(yīng)用。因此菌種保藏工作是我所遺傳育種研究室長期研究的課題。菌種保藏的基本原理是采用低溫干燥、真空隔氧的方法，來控制菌絲的繁殖和減慢菌絲代謝的速度，使它處于休眠和半休眠狀態(tài)，常用的保種方法有低溫斜面保藏、液體石蠟法保藏、硅膠保藏、冷凍干燥保藏、蒸餾水保藏和液氮超低溫保藏方法等，其中液氮保藏方法經(jīng)過30年來的研究證實是一種最穩(wěn)定、長效的微生物菌種保藏手段，蘑菇菌種的液氮保藏方法研究最早在美國模式菌種庫ATCC和賓州大學(xué)進行，Hwang于 1972年應(yīng)用超低溫技術(shù)保藏蘑菇菌種的初步結(jié)果表明是有希望的[1]，隨后San Antonio于1978年報道了應(yīng)用液氮成功地保藏蘑菇菌種達9年之久，其生存能力和蘑菇產(chǎn)量不受影響[2]。

Jodon等也報道了8個商業(yè)栽培雙孢蘑菇品種液氮保藏10年后，沒有明顯的形態(tài)和生理特性的變化[3]。英國溫室作物研究所Challen MP等對蘑菇菌種的保藏進行了系統(tǒng)的研究，認為液氮可長期保存蘑菇菌種，并于1986年發(fā)表了液氮菌種使用聚丙烯吸管安瓿的保藏容器的改進。我國中科院微生物研究所陳燕妍，于1987年進行了擔(dān)子菌菌種24屬43種122株的液氮超低溫保藏的研究，結(jié)果表明不同冷凍保護劑對菌株存活率有很大的影響，冷凍的快慢、解凍的快慢也是影響菌株存活率的主要因素之一[5]。Suman BC、Sobieralski K等報道雙孢蘑菇菌種經(jīng)過液氮保藏后，蘑菇菌絲生長速度及產(chǎn)量均不會受到影響[6，7]。本文對雙孢蘑菇菌種的液氮保藏方法進行了系統(tǒng)研究，并經(jīng)過成活率測定及出菇栽培的驗證，以其獲得雙孢蘑菇菌種液氮保藏的有效方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

雙孢蘑菇菌株As2796、As4607，由福建省農(nóng)科院食用菌研究所種質(zhì)資源與遺傳育種研究室保藏提供。

1.1.2 液氮保藏的基質(zhì)

PDA、小麥、小米等。

1.1.3 冷凍保護劑

5%、10%甘油，5%、10%二甲亞砜。

1.1.4 安瓿管

聚丙烯吸管安瓿管。

1.2 方法

1.2.1 冷凍方法

極速冷凍，即直接把裝有菌種的安瓿管從室溫放入液氮中保藏；慢速冷凍，即把裝有菌種的安瓿管先在液氮罐口預(yù)冷，緩慢地從上往下降，大約30 min后，安瓿管溫度降至－40℃時，再把安瓿管浸入液氮。

1.2.2 解凍方法

極速解凍，即從液氮中取出的安瓿管直接放入38℃的溫水中快速解凍；慢速解凍，即從液氮中取出的安瓿管放在室溫條件下緩慢解凍。

1.2.3 存活率計算

經(jīng)液氮保藏的菌種，取出解凍活化后移接至PDA培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)，計算正常萌發(fā)的接種塊占總移接接種塊的比率。

1.2.4 出菇試驗

按福建省蘑菇標(biāo)準(zhǔn)綜合體中的蘑菇規(guī)范化栽培技術(shù)進行箱式種植，分析各品種的產(chǎn)量、質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基質(zhì)對菌種液氮保藏存活率的影響

不同培養(yǎng)基質(zhì)對蘑菇菌種液氮保藏存活率的影響，見表1。

結(jié)果表明，3種不同培養(yǎng)基存活率存在一定的差異。以PDA為培養(yǎng)基質(zhì)的菌種，試驗的2個品種以及采用不同的冷凍保護劑均可獲得100%的存活。以小麥為培養(yǎng)基質(zhì)與10%甘油冷凍保護劑組合，存活率可達98%，以小麥為培養(yǎng)基質(zhì)與10%二甲亞砜冷凍保護劑組合，存活率只有88%～89%，以小米為培養(yǎng)基質(zhì)與不同的冷凍保護劑組合，存活率可達94%～98%。

表1 不同培養(yǎng)基的液氮保藏存活率

2.2 保護劑對菌種液氮保藏的存活率影響

保護劑對蘑菇菌種液氮保藏的存活率影響見表2。

表2 冷凍保護劑對菌種液氮保藏存活率影響

結(jié)果表明，2種保護劑均以10%濃度可獲得100%的存活率，在5%濃度下的存活率只有97%～98%，2種保護劑之間無明顯的差異。

2.3 凍結(jié)速率對菌種液氮保藏成活率的影響

凍結(jié)速率對菌種液氮保藏成活率的影響見表3。

2個品種及不同冷凍保護劑，慢速凍結(jié)的存活率均為100%，快速凍結(jié)的存活率只有76%～84%之間，快速凍結(jié)會造成液氮保藏中菌種的大量死亡。

2.4 菌種解凍方式對液氮菌種保藏存活率的影響

菌種解凍方式對液氮菌種保藏存活率的影響見表4。2個品種的快速解凍方式，其菌種存活率均為100%，而慢速解凍方式的菌種存活率只有60%～63%，慢速解凍造成了液氮保藏中的菌種在恢復(fù)生長時大量死亡。

表3 凍結(jié)速度對液氮菌種保藏成活率的影響

表4 解凍快慢對液氮菌種保藏存活率的影響

2.5 液氮保藏菌種對栽培的產(chǎn)量、質(zhì)量影響

液氮保藏菌種對栽培的產(chǎn)量、質(zhì)量影響見表5。

表5 液氮保藏菌種對菌株產(chǎn)量、質(zhì)量的影響

液氮保藏菌種和常規(guī)保藏菌種的產(chǎn)量、質(zhì)量間均無明顯差異，2個供試的不同品種表現(xiàn)完全一致。

3 討論

液氮菌種保藏的關(guān)鍵因素之一是選擇合適的冷凍保護劑，液氮保藏中使用保護劑是防止菌絲中的水成為冰晶，減少細胞膜受損，其一般分為2種類型：一類是進入細胞內(nèi)，如甘油、二甲亞砜；另一類是細胞外的，大部分是大分子的物質(zhì)，如聚乙烯吡咯酮、淀粉、蛋白質(zhì)等。在真菌保藏中主要是使用進入細胞內(nèi)的冷凍保護劑，如甘油、二甲亞砜。在本文的液氮保藏的對比試驗中，2種保護劑效果沒有明顯的差異。由于二甲亞砜具有強烈的揮發(fā)性氣體特性，操作過程中會造成空氣污染及人體傷害，因此甘油更適合作為雙孢蘑菇液氮保藏中的冷凍劑。

真菌的液氮保藏的凍結(jié)速度直接影響菌株的存活率。凍結(jié)方法主要分為2種，即快速凍結(jié)和慢速凍結(jié)。快速凍結(jié)即把菌種直接從室溫進入液氮中，這樣溫度變化大約有200℃·min－1～300℃·min－1， 而慢速凍結(jié)是先控制降溫速度，以 1℃·min－1～2℃·min－1的降溫速度進行降溫， 從室溫降至－40℃左右，然后再進入液氮罐中。大部分真菌的液氮保藏菌種試驗均顯示出慢凍結(jié)可獲得較高的存活率[4，5]，與本文實驗結(jié)果相符，這主要是由于降溫速度過快，細胞內(nèi)形成較大的冰晶而使細胞膜受損，增加菌種的死亡率。目前液氮保藏菌種均采用慢速凍結(jié)的方法進行冷凍操作。

在液氮保藏菌種的解凍過程中，細胞內(nèi)的冰晶會對細胞造成傷害，從而引起菌種的死亡，為了提高菌種的存活率，采用快速解凍方式，使細胞內(nèi)的冰晶快速溶解，減少冰晶對細胞膜損害的時間，并且能夠使細胞內(nèi)外滲透壓迅速達到平衡，本文采取快速解凍的方法，菌種存活率達到100%，取得良好的效果。

液氮保藏菌種可以完整保存該菌株的栽培特性，液氮保種方式正逐步取代常規(guī)的冰箱冷藏，特別是隨著雜交菌株的不斷應(yīng)用，由于雜種本身所特有的不穩(wěn)定因素，應(yīng)用常規(guī)保種易造成菌種的退化，經(jīng)過多年努力的成果很快便因菌株的退化而不能繼續(xù)使用。液氮保藏菌種從根本上解決了蘑菇雜交菌種保藏的難題，使優(yōu)良的雜交菌株能夠長期發(fā)揮作用。

[1]Hwang SW.Stability of spawn stocks of the cultivated mushroom after 26 months liquid nitrogen refrigeration[J].Mushroom Sci,1972(8):35－38.

[2]San Antonio JP.Stability of spawn stocks of the cultivated mushroom stored for nine years in liquid nitrogen (－160 to－196 C)[J].Mushroom Sci.,1978(10):103－133.

[3]Jodona MH,Roysea DJ,Jong SC.Productivity of Agaricus brunnescens stock cultures following 5－,7－,and 10－year storage periods in liquid nitrogen[J].Cryobiology,1982(19):602－606.

[4]Challen MP,Elliott TJ.Polypropylene straw ampoules for the storage of microorganisms in liquid nitrogen[J].Journal of Microbiological Methods,1986(5):11－23.

[5]陳燕妍.超低溫凍結(jié)保藏擔(dān)子菌[J].真菌學(xué)報，1987，6(2)：110－117.

[6]Suman BC,Jandaik CL.Preservation of culture of Agaricus bisporus(Lange)Sing.in liquid nitrogen and its effect on yield and characters of fruiting bodies[J].Indian Journal of Mycology and Plant Pathology,1991,21(1):34－37.

[7]Sobieralski K,Salwin M.Effect of spawn storage at the temperature of liquid nitrogen of four strains of field mushroom Agaricus bisporus(Lange)Imbach on its growth and pinhead setting[J].Roczniki Akademii Rolniczejw Poznaniu,2006,40(379):43－51.