經(jīng)前舒顆粒對(duì)郁怒反應(yīng)模型大鼠海馬腦區(qū)基因表達(dá)譜的影響

郭英慧，高 杰，徐凱勇，宋春紅，喬明琦

(山東中醫(yī)藥大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，山東 濟(jì)南 250355)

怒是影響人體健康的重要情志因素，其在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制已成為研究的熱點(diǎn)之一。前期研究表明:憤怒和郁怒是人們發(fā)怒的兩種表達(dá)方式，分別對(duì)焦慮和抑郁及其相關(guān)癥狀產(chǎn)生起重要作用［1］。臨床回顧性流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示:郁怒與抑郁癥、心腦血管疾病、癌癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。郁怒的產(chǎn)生及其誘發(fā)的情志病證的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多個(gè)系統(tǒng)，具體作用機(jī)制尚不清楚［4］。用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究情志病證，這是當(dāng)今中西醫(yī)研究的重要課題。基因芯片技術(shù)以其快速、高效、高通量的特點(diǎn)已成為研究復(fù)雜疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的有力工具之一。因此，本研究擬借助基因芯片技術(shù)，研究調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒對(duì)郁怒反應(yīng)模型大鼠海馬基因表達(dá)譜干預(yù)作用并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康♂Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，SPF級(jí)，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào) SCXK(魯)20050015。

1.1.2主要試劑和儀器TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司);經(jīng)前舒顆粒(主要成分:白芍、當(dāng)歸、柴胡、白術(shù)、丹皮、香附、甘草、郁金等藥組成。秦皇島市山海關(guān)制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào):Z20053587);RT-PCR反應(yīng)試劑包括 M-MLVReverse、dNTP Mixture、rTaq、DNaseⅠ(大連TaKaRa生物公司)。引物合成由濟(jì)南博亞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。大鼠表達(dá)譜芯片Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array(上海生物芯片有限公司)，A260/A280測(cè)定儀，Spectrophotometer ND21000(NanoDrop);Agilent掃描儀。

1.2方法

1.2.1大鼠造模、分組及行為學(xué)評(píng)價(jià)依據(jù)文獻(xiàn)［5］制備憤怒、郁怒反應(yīng)大鼠模型。首先篩選曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、糖水偏好得分相近大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，社會(huì)隔離加居住入侵造模刺激1周，依據(jù)攻擊行為區(qū)分出憤怒、郁怒組大鼠模型，挑選出模型組中屬郁怒反應(yīng)大鼠，繼而將郁模組分為繼續(xù)造模組和模型給藥組。即實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常組、郁怒模型組(簡(jiǎn)稱郁模組)、經(jīng)前舒給藥組(簡(jiǎn)稱郁藥組)，每組10只。正常組、郁模組(造模同時(shí))灌胃給予滅菌飲用水，郁藥組造模同時(shí)灌胃給予經(jīng)前舒顆粒，每天上午9:00灌胃給藥1次，給藥量0.1 ml·g-1體質(zhì)量(相當(dāng)于人臨床8倍劑量［6］，濃度1 ∶1，即1 ml藥液含原生藥1 g)，連續(xù)給藥7 d。采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)［5］。

1.2.2大鼠腦組織取材評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)后，每只大鼠迅速斷頭、開(kāi)顱、分離腦置于冰上培養(yǎng)皿中，無(wú)菌操作于冰上迅速剝離出海馬組織，分別放入1.5 ml離心管，置于液氮中冷凍保存。

1.2.3大鼠基因芯片的檢測(cè)

1.2.3.1組織總RNA提取 取凍存的大鼠海馬組織，按組別用組織勻漿機(jī)分別混合均勻，TRIzol試劑抽提海馬組織的總RNA，進(jìn)行紫外分析及電泳檢測(cè)。QIAGEN RNeasy Kit純化總RNA，測(cè)定其濃度后，-80℃保存。

1.2.3.2探針制備、芯片雜交掃描及數(shù)據(jù)提取 提取的RNA在干冰的保護(hù)下交上海生物芯片有限公司，待確認(rèn)質(zhì)量后參考Affymetrix基因芯片實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用熒光Cy3-dCTP標(biāo)記郁模組和郁藥組總RNA，用Cy5-dCTP標(biāo)記正常組的總RNA。然后用定量的Cy3和Cy5標(biāo)記的探針，進(jìn)行芯片雜交、洗滌、干燥。芯片結(jié)果用 Affymetrix掃描儀進(jìn)行掃描，GCOS1.4軟件讀取數(shù)據(jù)［7］。

1.2.3.3差異表達(dá)基因篩選與生物信息學(xué)分析 由上海生物芯片有限公司對(duì)掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字化處理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì);差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為L(zhǎng)og-ratio≥0.8為上調(diào)基因，Log-ratio≤0.8為下調(diào)基因，P＜0.5。數(shù)據(jù)分析軟件采用博奧生物公司的GO分子功能注釋系統(tǒng)，將差異基因分子功能、生物過(guò)程、細(xì)胞成分進(jìn)行歸類，并利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)(BioCarta、KEGG、GenMApp、NCBI Gene Bank等)對(duì)差異表達(dá)基因涉及的調(diào)控路徑進(jìn)行檢索分析［7］，同時(shí)參閱大量相關(guān)文獻(xiàn)。

1.2.4RT-PCR實(shí)驗(yàn)分別取3只正常組、郁模組和郁藥組大鼠的海馬組織，提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，采用Primer 3軟件，選取基因芯片檢測(cè)結(jié)果中Htr3b和GABABR2基因設(shè)計(jì)引物，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證［8］。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)以±s記錄。采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及糖水偏好實(shí)驗(yàn)由Fig 1可見(jiàn):造模刺激1周后郁怒大鼠模型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分上升(P＜0.05)，而糖水偏好系數(shù)則下降(P＜0.05);藥物干預(yù)后上述指標(biāo)均得到一定程度恢復(fù)，但與郁模組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

Fig 1 Open-field test(A)and sucrose preference test(B)results of control，anger-in model，Jingqianshu treatment rats(ˉx ± s，n=10)

2.2組織樣品RNA檢測(cè)和芯片檢測(cè)質(zhì)量判定所提取總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260nm/OD280nm比值介于1.9～2.1;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，28 S、18 S兩條帶清晰，且無(wú)拖尾現(xiàn)象，提示RNA完整性較好，總RNA濃度、純度及完整性符合實(shí)驗(yàn)要求(Fig 2)?；蛐酒瑱z測(cè)結(jié)果顯示，Cy3/Cy5比值正常，芯片檢出率在0.99以上，均一性良好，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到要求。

Fig 2 RNA electrophoresis results of control，anger-in model，Jingqianshu treatment.

2.3差異表達(dá)基因的功能分布及其調(diào)控路徑

2.3.1各組差異表達(dá)基因的功能分布按Gene Ontology功能分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行檢索分類，由于某些差異表達(dá)基因并非僅有一個(gè)功能或僅通過(guò)一條調(diào)控路徑。經(jīng)查基因庫(kù)，造模組與正常組比較共檢出63個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和153個(gè)表達(dá)下調(diào)基因，涉及蛋白結(jié)合活性等分子功能的基因259個(gè)，有關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程的基因281個(gè)，涉及膜組分等細(xì)胞成分的基因204個(gè)。郁藥組與郁模組比較共檢出127個(gè)不同差異表達(dá)基因，其中郁模組/正常組上調(diào)而郁藥組/正常組基因下調(diào)基因有55個(gè)，郁模組/正常組下調(diào)而郁藥組/正常組基因上調(diào)基因有72個(gè)，主要有各類激素受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、代謝酶、離子通道蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞因子受體等。選取部分郁藥組與郁模組比較差異表達(dá)基因進(jìn)行分子功能注釋，見(jiàn)Tab 1。

2.3.2各組差異表達(dá)基因的調(diào)控路徑利用KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因涉及的調(diào)控路徑進(jìn)行檢索分析發(fā)現(xiàn)，多基因可通過(guò)一條調(diào)控路徑。造模組與正常組比較發(fā)現(xiàn)差異基因共涉及124條調(diào)控路徑，最多者6個(gè)基因/路徑，為神經(jīng)活化配體-受體交互作用路徑;其次為4個(gè)基因/路徑和3基因/路徑，為甘油磷脂代謝路徑和促分裂原活化蛋白激酶路徑。另外還有一基因通過(guò)多條調(diào)控路徑情況，最多的為10條路徑/基因，分別是核糖體蛋白S6激酶(Rps6kb1)和磷脂酶Ce1(Plce1)。郁藥組與郁模組比較發(fā)現(xiàn)差異基因與80條調(diào)控路徑有關(guān)，通過(guò)調(diào)控基因最多的為4基因/路徑，為神經(jīng)活化配體-受體交互作用路徑和離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控路徑。同時(shí)Rps6kb1和Plce1基因也是涉及調(diào)控路徑最多的基因，為10條路徑/基因。

2.4RT-PCR驗(yàn)證基因芯片檢測(cè)結(jié)果選擇基因芯片結(jié)果提示的有差異表達(dá)的Htr3b和GABABR2基因進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，Htr3b和GABABR2基因表達(dá)結(jié)果與基因芯片數(shù)據(jù)基本一致(Fig 3)，說(shuō)明基因芯片檢測(cè)結(jié)果是可靠的。

3 討論

Tab 1 Selected genes differentially expressed in the hippocampus from Jingqianshu treatment and anger-in model rat

Fig 3 Electrophoresis results of Htr3b(A)and GABABR2(B)RT-PCR test from rat hippocampus

居住入侵及社會(huì)隔離是社會(huì)壓力應(yīng)激領(lǐng)域經(jīng)典造模方法，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和糖水偏好為動(dòng)物行為學(xué)領(lǐng)域經(jīng)典評(píng)價(jià)方法，國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界應(yīng)用以上方法已成功制備出抑郁癥、經(jīng)前煩躁易怒等多種情緒類疾病動(dòng)物模型［5］。本實(shí)驗(yàn)采用居住入侵結(jié)合社會(huì)隔離的方法制備憤怒、郁怒情緒大鼠模型［8］。與正常組相比，郁模組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總分明顯上升，而糖水偏好系數(shù)顯著下降，初步判定模型制備成功，用藥干預(yù)后負(fù)性情緒能得到一定程度地改善，但郁藥組與郁模組比較差異未見(jiàn)顯著性(P＞0.05)，這與模型用藥時(shí)間較短有關(guān)，但仍能很大程度上說(shuō)明調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒能夠糾正郁怒反應(yīng)模型大鼠行為學(xué)變化。

中藥復(fù)方是以多組分、多靶點(diǎn)發(fā)揮效應(yīng)，其對(duì)基因的調(diào)控可能是通過(guò)群體基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)?；蛐酒哂写笈?、同時(shí)篩選和整體信息處理的性質(zhì)，本研究利用此特點(diǎn)對(duì)經(jīng)前舒顆粒干預(yù)郁怒大鼠海馬腦區(qū)基因表達(dá)譜進(jìn)行初步分析，了解該方應(yīng)用后的一些基因反應(yīng)模式，以期從基因水平上探索其可能的藥物靶點(diǎn)及作用機(jī)制。結(jié)果顯示該方可使郁模組海馬組織中的較多基因產(chǎn)生差異性表達(dá)，提示方中的藥物作用靶點(diǎn)較多，是通過(guò)整體調(diào)節(jié)基因的高/低表達(dá)發(fā)揮藥物的作用。在上調(diào)或下調(diào)的一些已知基因中，其功能與保護(hù)神經(jīng)元、抑制細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突觸傳遞保護(hù)、穩(wěn)定Ca2+通道、拮抗缺氧等有關(guān)，這些基因或是藥物作用靶點(diǎn)或是藥物信號(hào)傳導(dǎo)通路上的某個(gè)環(huán)節(jié)。差異表達(dá)基因多屬于神經(jīng)活化配體—受體交互作用、甘油磷脂代謝和促分裂原活化蛋白激酶等調(diào)控路徑，說(shuō)明這些調(diào)控路徑與經(jīng)前舒顆?？赡艿乃幬锔深A(yù)分子機(jī)制密切相關(guān)，這可能是該方干預(yù)郁怒情緒反應(yīng)作用的基礎(chǔ)。

舉以下幾個(gè)基因?yàn)槔懻?① Htr3b(NM_022189)和催乳素受體Prlr(NM_001034111)基因，有報(bào)道Htr3b受體參與調(diào)控中樞性惡心、嘔吐和應(yīng)激性腸綜合征等過(guò)程，基因多態(tài)性與女性嚴(yán)重抑郁癥密切相關(guān)。Prlr受體在泌乳、生長(zhǎng)發(fā)育、內(nèi)分泌行為、免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要生理功能［9-10］。經(jīng)前舒顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)這些激素及神經(jīng)遞質(zhì)受體，進(jìn)而參與神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫系統(tǒng)功能失調(diào)調(diào)節(jié)過(guò)程，這與以往報(bào)道慢性憤怒應(yīng)激與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能失調(diào)密切相關(guān)等研究結(jié)果相符［8，11］。② 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 Fgfr2(NM_001109892)和代謝型谷氨酸受體 Grm8(NM_022202)，大量研究表明成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF可通過(guò)與受體Fgfr2特異性結(jié)合，激活酪氨酸激酶，影響谷氨酸受體蛋白、鈣結(jié)合蛋白等的表達(dá)而穩(wěn)定Ca2+通道，拮抗缺氧、興奮性氨基酸、自由基等的損害，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展，從而保護(hù)神經(jīng)元［12-13］。Grm8(NM_022202)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成、可塑性改變以及學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知的突觸傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其功能異常可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損害［14］。經(jīng)前舒顆?？芍?Fgfr2、Grm8表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)促進(jìn)抗氧化應(yīng)激，增加Grm8突觸前抑制，減少谷氨酸的釋放，對(duì)海馬神經(jīng)元起到保護(hù)性效應(yīng)，起到抑制其凋亡作用。③糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件結(jié)合蛋白Gmeb2(NM_031803)，海馬是糖皮質(zhì)受體含量最高的腦區(qū)，應(yīng)激時(shí)海馬極易受到高濃度的糖皮質(zhì)激素選擇性的攻擊，導(dǎo)致海馬整體受損，突觸可塑性降低，神經(jīng)元萎縮、丟失，并進(jìn)一步影響到學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)功能［15-16］。經(jīng)前舒顆粒可上調(diào) Fgfr2、Gmeb2基因表達(dá)，推測(cè)可能通過(guò)拮抗缺氧、自由基的損害，減少游離糖皮質(zhì)激素含量，從而對(duì)應(yīng)激型海馬神經(jīng)元起保護(hù)作用。

郁怒情緒及與其密切相關(guān)的情志病證的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，本研究雖初步證實(shí)經(jīng)前舒顆?？赏ㄟ^(guò)改變郁怒情緒大鼠海馬腦區(qū)一些基因反應(yīng)模式，能夠部分糾正模型大鼠行為學(xué)變化，但很大部分基因功能還遠(yuǎn)未完全搞清楚。在后續(xù)的研究中，我們將對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并利用相關(guān)情志病證動(dòng)物模型或精神藥理學(xué)相關(guān)研究來(lái)佐證基因芯片發(fā)現(xiàn)的一些陽(yáng)性結(jié)果，為深入探討與郁怒情緒密切相關(guān)的情志病證的發(fā)生和發(fā)病機(jī)制提供基本依據(jù)和研究方向。

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