香菇多糖對免疫抑制小鼠腸道派氏結(jié)T細(xì)胞的影響

江益平，馬方勵，周 聯(lián)，王 青，董 燕

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所免疫研究室;2.無限極(中國)有限公司，廣州廣東 510405)

早在1968年，日本科學(xué)家就利用熱水浸提法從香菇子實(shí)體中提取、分離、純化出6種胞外多糖，lentinan、LC-11、LC-12、LC-13、EC-11 和 EC-14，同時他們發(fā)現(xiàn)這6種多糖中l(wèi)entinan和LC-11具有抗腫瘤的生物學(xué)活性［1］。經(jīng)過對香菇多糖的構(gòu)效關(guān)系的研究，人們發(fā)現(xiàn)具備β-(1→3)連接的葡聚糖主鏈同時連接β-(1→6)側(cè)鏈的香菇多糖均會表現(xiàn)明顯的生物學(xué)活性，且分子量越大，生物學(xué)活性越顯著［2］。香菇多糖的抗腫瘤活性被認(rèn)為與其活化T細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞介素產(chǎn)生，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能等免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)，臨床也已經(jīng)將其作為腫瘤治療的輔助藥物［3-4］。但是，有關(guān)香菇多糖對腸道黏膜免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)作用至今少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先從體重增長趨勢、胸腺指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖能力和DTH反應(yīng)能力方面確定香菇多糖對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的系統(tǒng)免疫功能的影響。同時，在DTH模型基礎(chǔ)上，通過免疫抑制小鼠小腸派氏結(jié)數(shù)目以及派氏結(jié)中T淋巴細(xì)胞比例和活化情況觀察香菇多糖對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠腸道派氏結(jié)T淋巴細(xì)胞的影響，以確定香菇多糖對腸道黏膜免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1動物和藥物NIH小鼠，♂，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號:SCXK(粵)2006-0015。香菇多糖噴干粉由無限極(中國)有限公司提供，依照文獻(xiàn)描述的硫酸-苯酚法結(jié)合3，5-二硝基水楊酸比色定糖法檢測多糖的含量為 0.52［5］;環(huán)磷酰胺(Cyclophosp homide，CY)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號H32020875。

1.2試劑、耗材和儀器2，4-二硝基氟苯(DNFB)為日本東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品;RPMI 1640培養(yǎng)基，為Gibco產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)，為PAA產(chǎn)品;美洲商陸(PMW)、刀豆蛋白 A(ConA)和MTT為Sigma產(chǎn)品;APC-anti-mouseCD3，PE-anti-mouse CD69，F(xiàn)ITC-anti-mouse CD4，PE-anti-mouse CD8 為eBioscience產(chǎn)品。96孔平底培養(yǎng)板，美國Corning公司產(chǎn)品;其它試劑均為進(jìn)口分析純或國產(chǎn)分析純試劑。多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司;電子分析天平，德國Sartorius產(chǎn)品，d=0.1 mg;流式細(xì)胞儀，美國BD公司;臺式冷凍高速離心機(jī)，美國Beckman產(chǎn)品。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用單因素方差分析。

1.4方法

1.4.1LNT對腸道黏膜免疫系統(tǒng)的影響

1.4.1.1動物分組、給藥和DTH模型建立 28只NIH小鼠按體重隨機(jī)分成4組，正常組、模型組、香菇多糖低劑組、香菇多糖高劑組，每組7只動物。其中香菇多糖低劑組每天灌胃香菇多糖0.4 mg·g-1體質(zhì)量，香菇多糖高劑組每天灌胃香菇多糖0.8 mg·g-1體質(zhì)量，正常組和模型組以純水代替。給藥d 4，模型組和給藥組腹腔注射環(huán)磷酰胺85 μg·g-1體質(zhì)量，正常組用生理鹽水對照，給藥周期為7 d。

給藥的d 2，各組小鼠的背部脫毛劑脫毛1 cm×1 cm，在脫毛后的d 2，脫毛區(qū)用0.44 mol·L-1丙酮20 μl涂抹致敏小鼠。在給藥的d 7，各組小鼠的右耳用0.08 mol·L-1DNFB丙酮20 μl進(jìn)行攻擊，左耳用丙酮做對照。

1.4.1.2派氏結(jié)淋巴細(xì)胞比例和活化檢測 攻擊30 h后，脫頸椎處死小鼠，打開腹腔取出全段小腸，計(jì)數(shù)小腸派氏結(jié)的個數(shù)。取出3～4個派氏結(jié)，置于盛有冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中。常規(guī)方法制備淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×1010·L-1，APC-antimouse CD3，F(xiàn)ITC-anti-mouse CD4 和 PE-anti-mouse CD8流式抗體檢測T細(xì)胞比例和亞群變化;APC-anti-mouse CD3和PE-anti-mouse CD69流式抗體檢測T細(xì)胞活化情況。

1.4.2香菇多糖對整體免疫系統(tǒng)的影響

1.4.2.2DTH實(shí)驗(yàn) 動物分組、給藥和DTH模型建立同上。在DNFB丙酮攻擊右耳廓30 h后，脫頸椎處死小鼠，剪下左右耳廓，打孔稱重，計(jì)算耳腫脹度。

2 結(jié)果

2.1香菇多糖對系統(tǒng)免疫功能的影響腹腔注射85 μg·g-1體重環(huán)磷酰胺可以減輕小鼠胸腺質(zhì)量，抑制PWM刺激的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的體外增殖及其遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力(P＜0.01或P＜0.05)，說明此劑量的環(huán)磷酰胺可以有效抑制小鼠系統(tǒng)免疫的正常功能。

與免疫抑制模型比較，香菇多糖組的小鼠胸腺指數(shù)雖然沒有明顯恢復(fù)，但均表現(xiàn)有一定程度的回升趨勢。而香菇多糖對PWM刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力有明顯改善作用(P＜0.01或P＜0.05)，并與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。說明香菇多糖對免疫抑制小鼠的整體免疫系統(tǒng)有正向調(diào)節(jié)作用。見Tab 1、2。

Tab 1 Effects of lentinan on thymus index of mice(±s，n=7)

Tab 1 Effects of lentinan on thymus index of mice(±s，n=7)

＊＊P＜0.01 vs normal

Group Thymus index Normal 35.76±6.09 Model 22.19±3.90＊＊LNT 400 mg·kg-1 25.54±2.72 LNT 800 mg·kg-125.45±5.22

Tab 2 Effects of lentinan on lymphocyte proliferation of spleen lymphocytes and delayed type hypersensitivity of mice(±s，n=7)

Tab 2 Effects of lentinan on lymphocyte proliferation of spleen lymphocytes and delayed type hypersensitivity of mice(±s，n=7)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model

Group Stimulation index Ear swelling/mg Normal 2.11±0.69 18.91±4.46 Model 1.14±0.25* 12.36±1.62＊＊LNT 400 mg·kg-1 1.59±0.26# 15.64±3.30 LNT 800 mg·kg-1 1.75±0.04## 17.63±4.66#

2.2香菇多糖對腸道黏膜免疫功能的影響腹腔注射85 μg·g-1環(huán)磷酰胺能明顯升高派氏結(jié)中CD3+T淋巴細(xì)胞的比例，降低T淋巴細(xì)胞的正常活化水平，說明此劑量的環(huán)磷酰胺可以有效抑制小鼠的腸道黏膜免疫系統(tǒng)功能(P＜0.01或P＜0.05)。見 Tab 3、Fig 1、2。

Tab 3 Effects of lentinan on the proportion and activation of T lymphocytes in PPs of DTH mice(±s，n=7)

Tab 3 Effects of lentinan on the proportion and activation of T lymphocytes in PPs of DTH mice(±s，n=7)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal;##P＜0.01 vs model

Group CD3+cells/% CD69+cells/%Normal 22.90±5.00 36.60±2.20 Model 56.66±7.99＊＊ 18.48±3.24*LNT 400 mg·kg-1 53.75±8.11 21.82±7.48 LNT 800 mg·kg-1 29.38±5.86## 33.58±9.47##

與免疫抑制模型比較，灌服香菇多糖的小鼠小腸派氏結(jié)中的CD3+T淋巴細(xì)胞的相對比例及其活化水平都表現(xiàn)出明顯的恢復(fù)趨勢，其中0.8 mg·g-1劑量組的小鼠派氏結(jié)T細(xì)胞比例和活化水平接近正常組(P＜0.01)。說明香菇多糖對免疫抑制小鼠的腸道黏膜免疫系統(tǒng)有正向調(diào)節(jié)作用。

3 討論

人和動物的腸黏膜面積巨大，約2倍于皮膚的面積，每時每刻都接觸大量的抗原，承擔(dān)著重要的免疫功能，它是機(jī)體抗感染的第一道防線，也是機(jī)體感染的主要部位之一［6-7］。微生物學(xué)與傳染病學(xué)家Montagne曾經(jīng)說過“腸道內(nèi)壁是人體最大的免疫器官”，由此可以看出腸道黏膜免疫系統(tǒng)在人體免疫系統(tǒng)中占據(jù)的重要地位。派氏結(jié)是存在于哺乳動物小腸段的集合淋巴小結(jié)，常沿腸系膜對側(cè)分布，其中富含胸腺源性T細(xì)胞和B細(xì)胞，是腸道黏膜免疫系統(tǒng)的免疫誘導(dǎo)部位［8］。PP結(jié)是刺激sIgA分泌和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖活化抵御腸道內(nèi)有害物質(zhì)侵襲的主要部位，PP結(jié)的大小、數(shù)量及其中淋巴細(xì)胞數(shù)量和活性狀態(tài)等可以反映腸道黏膜局部的免疫狀態(tài)［9-10］。

Fig 1Effects of lentinan on percentage of T cells in PPs of DTH mice(±s，n=7)

Fig 2Effects of lentinan on activation of T cells in PPs of DTH mice(±s，n=7)

香菇多糖對系統(tǒng)免疫功能的影響已經(jīng)得到很多研究的證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)中，通過PWM刺激小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖和小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力兩方面，并結(jié)合小鼠體重增長趨勢和胸腺指數(shù)觀察香菇多糖對系統(tǒng)免疫功能的影響。結(jié)果顯示，香菇多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的系統(tǒng)免疫抑制狀態(tài)有改善和恢復(fù)作用。在確立香菇多糖對系統(tǒng)免疫的正向調(diào)節(jié)作用基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)在DTH模型小鼠上，通過腸道派氏結(jié)通過體外DNFB致敏、攻擊，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，機(jī)體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞會因此而發(fā)生增殖活化等現(xiàn)象，以觀察香菇多糖對免疫抑制小鼠腸道派氏結(jié)中T細(xì)胞的影響。在DTH模型基礎(chǔ)上，前后PP結(jié)中T淋巴細(xì)胞比例、亞群及活化的變化情況，一方面可以觀察香菇多糖是否能夠增強(qiáng)機(jī)體淋巴細(xì)胞對外來抗原刺激敏感性，另一方面可以放大香菇多糖的免疫藥效作用，便于結(jié)果的檢測和統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香菇多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的PP結(jié)T、B淋巴細(xì)胞比例失衡，T淋巴細(xì)胞活化水平降低等腸道黏膜免疫紊亂狀態(tài)有明顯改善作用，對腸道黏膜免疫系統(tǒng)的功能具有正向調(diào)節(jié)的作用。

有學(xué)者通過口服與注射兩種給藥途徑比較四君子復(fù)方總多糖對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠溶血素生成和遲發(fā)型超敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，口服給藥途徑的效果優(yōu)于注射給藥［11］。在本實(shí)驗(yàn)中，口服方式給予香菇多糖，小鼠的腸道黏膜免疫和系統(tǒng)免疫的紊亂和抑制狀態(tài)均表現(xiàn)出相應(yīng)改善，提示機(jī)體腸道黏膜免疫與系統(tǒng)免疫之間存在著某種聯(lián)系。作為系統(tǒng)免疫的一個重要組成部分，腸道黏膜免疫系統(tǒng)局部的免疫反應(yīng)可以通過淋巴細(xì)胞循環(huán)和歸巢等機(jī)制影響到系統(tǒng)免疫，由此，腸道黏膜免疫系統(tǒng)很可能是香菇多糖發(fā)揮免疫藥效的首要部位。

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