七氟烷后處理對大鼠缺血/再灌注損傷心功能和ERK1/2表達(dá)的影響

陳洪濤，雷春亮，李寶金，楊承祥，李 恒

(1.廣州市第八人民醫(yī)院，廣東廣州 510060;2.佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山 528000)

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶超家族成員，在介導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖、存活中起重要作用，可被多種信號激活［1］。在對再灌注損傷心肌保護(hù)機(jī)制的研究中，ERK1/2的激活可能起著重要的作用。揮發(fā)性麻醉藥后處理是近年來提出的一種對減輕再灌注損傷具有較大臨床意義的新方法［2］。研究表明，同缺血預(yù)處理［3］、藥物預(yù)處理［4］以及前幾年提出的缺血后處理［5］一樣，七氟烷等吸入麻醉藥能模擬缺血后處理，對再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用［6］。七氟烷是一種麻醉性能優(yōu)越，目前被認(rèn)為接近“理想”的新型吸入麻醉藥，人們對其后處理心肌保護(hù)機(jī)制的研究尚處于初級階段。本實驗旨在研究七氟烷對缺血/再灌注心肌細(xì)胞ERK1/2活性的影響，探討其心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物及試劑七氟烷(sevoflurane，批號7129，丸石制藥株式會社);2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC;Sigma，USA);PD98059(Sigma，USA);DMSO(衢州市瑞爾豐化工有限公司，批號20100210);Western細(xì)胞裂解液、SDS/PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS/PAGE凝膠配制試劑盒、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所);鼠單克隆抗磷酸化 ERK1/2［Phospho-p44/42 MAP Kinase(Thr202/Tyr204)(E10)Mouse mAb］和總的ERK1/2［p44/42 MAP Kinase(L34F12)Mouse mAb］抗體、兔多克隆抗磷酸化p70S6K〔Phospho-p70S6 Kinase(Thr421/Ser424)Antibody〕和總的 p70S6K(p70S6 Kinase Antibody)抗體(Cell Signalling Technology，USA);堿磷酶標(biāo)記抗小鼠、堿磷酶標(biāo)記抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。PD98059按說明書要求溶于DMSO(6.5 g·L-1)。

1.2動物選擇與分組SPF級SD♂大鼠，體質(zhì)量250～300 g［中山大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SYXK(粵)2007-0081］。(1)評估七氟烷后處理的心肌保護(hù)作用:64只SD♂大鼠隨機(jī)分為8組(n=8):假手術(shù)組(Sham)，缺血/再灌注組(Control)，后處理組(Post，Sevo，DMSO，PD98059，Post+PD，Sevo+PD)。(2)p-ERK1/2活性的測定:組別同上(n=6)，各組復(fù)灌15 min時取下心臟迅速液氮凍存。

1.3Langendorff心臟灌注模型的制備模型的制備同我們先前的研究［7］:大鼠腹腔注射500 U·kg-1肝素抗凝和40 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉，迅速開胸取心臟置于0℃的K-H液中，動脈插管，置于Langendorff灌注裝置上，以95%的O2和5%CO2飽和K-H液逆行灌注，溫度37℃ ，灌注壓10.4 kPa，pH(7.38 ±0.05)，K-H 液成分(mmol·L-1):NaCl 118，MgSO41.2，KCl 4.7，KH2PO41.2，NaHCO325，CaCl22.5，葡萄糖 11.1，EDTA-Na20.125。左室插管接壓力換能器(Maclab/4S)，經(jīng)Maclab/4S模擬換轉(zhuǎn)器(AD.2 Struments公司，澳大利亞)與machosh7200/90型計算機(jī)(Apple公司，美國)連接，連續(xù)監(jiān)測心功能指標(biāo)。Sham組持續(xù)灌注150 min;Control組平衡灌注30 min，缺血30 min，再灌注90 min;Post組在缺血/再灌注即刻進(jìn)行4個循環(huán)復(fù)灌25 s/缺血25 s，然后再灌注至150 min;Sevo組缺血復(fù)灌時給予含3.0V/V飽和七氟烷的K-H液灌注5 min，沖洗10 min，再灌注至150 min;DMSO和PD98059組復(fù)灌時分別給予含DMSO(＜0.2%)、PD98059(20 μmol·L-1)的K-H液灌注15 min;Post+PD組復(fù)灌時缺血后處理的同時給予15 min的PD98059(20 μmol·L-1);Sevo+PD組復(fù)灌時七氟烷后處理的同時給予15 min 的 PD98059(20 μmol·L-1)。

1.4功能學(xué)指標(biāo)的監(jiān)測左心耳處剪開一個小口，將帶有小乳膠水囊的測壓管經(jīng)二尖瓣口插入左心室，連接壓力換能器，通過連接于三通上的含水注射器，調(diào)節(jié)左心室內(nèi)水囊的容量使左心室舒張末壓(LVEDP)為0.5～0.8 kPa。持續(xù)監(jiān)測左心室功能指標(biāo):左室舒張末期壓 LVEDP、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室上升最大速率(+dp/dt)、左心室下降最大速率(-dp/dt)、心率(HR)。

1.5冠狀動脈流量測定在肺動脈圓錐處剪一小口，使冠狀動脈液自然流出，分別在平衡灌注末，再灌注30、60、90 min用量筒收集冠狀動脈流出液并測量其體積，單位以ml·min-1表示。

1.6梗死面積的測定用TTC染色法測定再灌注90 min后的心肌梗死面積。從-80℃冰箱中取出心臟，由心尖部向心底部取心室部分橫向切成1 mm厚度薄片若干，放入1%TTC磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，37℃水浴孵育20 min，染色過程中不時振蕩染色液使之與心肌充分接觸，存活心肌呈磚紅色，梗死區(qū)不著色呈灰白色，把心肌片用雙蒸水沖去多余的染料，并排置于濾紙上吸干水分，放在玻片上，用Image master圖像分析儀(Pharmacia Bioten公司，美國)分析梗死心肌面積占心肌總面積的百分比(梗死心肌面積/總心肌面積×100%)。

1.7Western blot法半定量測定p-ERK、pp70S6K取液氮凍存心肌的心室部分，Western細(xì)胞裂解液按說明書要求勻漿，勻漿液4℃ 14 000×g離心15 min，以 BSA 為標(biāo)準(zhǔn)，Bradford法［8］測定上清液蛋白濃度。按照每4 μl蛋白樣品加入1 μl SDS/PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)比例混合，沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。取等量40 μg樣本載到SDS/PAGE凝膠上電泳，電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜，Western封閉液封閉6 h，一抗4℃孵育24 h，二抗室溫緩慢振蕩孵育2 h，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)均以±s表示，應(yīng)用SPSS 13.00統(tǒng)計學(xué)分析軟件，組內(nèi)比較用配對t檢驗，同一時間、不同組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊性用Least significant difference(最小顯著差法)檢驗。

2 結(jié)果

2.1功能指標(biāo)Tab 1顯示各組平衡灌注末心功能指標(biāo)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，再灌注30、60、90 min，除Sham組外，其余各組心功能指標(biāo)明顯低于基礎(chǔ)值(P＜0.05)，同Sham組比，其余各組其余各組心功能指標(biāo)明顯下降(P＜0.05)，同Control組比，Sevo組和Post組的心功能指標(biāo)明顯上升(P＜0.05)，Sevo組和 Post組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見Tab 1。

2.2對梗死面積的影響Tab 2顯示復(fù)灌90 min后，Control組的梗死面積為41.7% ±5.1%，Sevo組和Post組的梗死面積分別為24.1%±3.5%和22.7% ±3.2%(P＜0.05)，Sevo組和Post組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見Fig 1，Tab 2。

2.3對胞質(zhì)中p-ERK1/2、p-p70S6K蛋白的影響Western blot分析，Control組的 p-ERK、p-p70S6K表達(dá)高于Sham組(P＜0.05);Sevo組和Post組的p-ERK、p-p70S6K表達(dá)進(jìn)一步高于Control組(P＜0.05);Sevo組和Post組的p-ERK、p-p70S6K表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見Fig 2 A，B。

3 討論

本實驗證實七氟烷后處理提高了復(fù)灌后期離體大鼠左心室的+dp/dt、-dp/dt、LVDP，降低了左心室的LVEDP，表明七氟烷后處理可以改善缺血/再灌心肌的收縮和舒張功能。復(fù)灌末心肌梗死面積的明顯減少，說明七氟烷后處理可以減輕心肌的缺血/再灌注損傷，具有明顯的心肌保護(hù)作用。

Tab 1 Hemodynamics(±s，n=8)

Tab 1 Hemodynamics(±s，n=8)

*P＜0.05 vs baseline(intragroup comparison);#P＜0.05 vs sham;△P＜0.05 vs control(intergroup comparison).R:reperfusion;Sham:Timematched perfusion;Control:Unprotected hearts exposed to ischemia-reperfusion;Post:Ischemia postconditioning;Sevo:Sevoflanrane postconditioning;DMSO:Dimethyl sulfoxide;PD=PD98059;LVEDP:Left ventricular end-diastolic pressure;LVDP:Left ventricular developed;+dp/dt:Inotropy;-dp/dt:Lusitropy;HR:Heart rate;CF:Coronary flow

Group Baseline R 30 min R 60 min R 90 min LVEDP/kPa Sham 0.71±0.08 0.76±0.08 0.78±0.12 0.97±0.11 Control 0.68±0.09 4.48±0.94*# 4.53±0.94*# 4.69±0.97*#Post 0.66±0.09 2.59±0.63*#△ 2.63±0.63*#△ 2.71±0.65*#△Sevo 0.70±0.08 2.67±0.69*#△ 2.73±0.72*#△ 2.81±0.70*#△DMSO 0.61±0.08 4.22±0.90*# 4.28±0.88*# 4.50±0.92*#PD 0.72±0.09 4.55±0.94*# 4.62±0.97*# 4.87±0.98*#Post+PD 0.65±0.08 4.04±0.85*# 4.20±0.86*# 4.30±0.89*#Sevo+PD 0.63±0.07 3.92±0.89*# 4.02±0.88*# 4.22±0.86*#LVDP/kPa Sham 16.8±1.5 16.1±1.6 15.8±1.7 15.3±1.6 Control 16.2±1.1 9.6±1.3*# 9.3±1.5*# 8.6±1.2*#Post 15.8±1.3 12.2±1.5*#△ 11.2±1.3*#△ 11.0±1.6*#△Sevo 16.0±1.3 11.8±1.2*#△ 11.7±1.3*#△ 11.2±1.5*#△DMSO 15.8±1.5 9.6±1.3*# 9.2±1.2*# 8.5±1.5*#PD 15.7±1.3 9.3±1.6*# 8.8±1.5*# 8.1±1.3*#Post+PD 16.4±0.9 10.0±1.6*# 9.6±1.7*# 9.7±1.5*#Sevo+PD 16.1±1.2 9.6±1.5*# 9.4±1.6*# 9.0±1.3*#+dp/dt/kPa·s-1 Sham 463±31 462±32 459±34 455±37 Control 459±48 230±41*# 224±38*# 218±36*#Post 452±41 337±43*#△ 334±42*#△ 329±46*#△Sevo 454±33 335±26*#△ 332±27*#△ 327±30*#△DMSO 453±34 227±29*# 219±29*# 215±26*#PD 450±36 225±34*# 217±33*# 212±31*#Post+PD 457±44 238±43*# 237±42*# 234±41*#Sevo+PD 455±37 235±32*# 232±30*# 227±29*#-dp/dt/kPa·s-1 Sham 345±30 344±30 341±31 334±32 Control 343±44 164±30*# 169±30*# 163±32*#Post 332±38 242±36*#△ 240±35*#△ 233±36*#△Sevo 336±28 240±23*#△ 234±24*#△ 229±26*#△DMSO 339±30 167±29*# 162±29*# 158±30*#PD 333±33 159±28*# 158±30*# 152±28*#Post+PD 341±43 175±36*# 172±36*# 168±35*#Sevo+PD 340±33 172±29*# 165±28*# 160±30*#CF/ml·min-1 Sham 14.1±0.8 13.9±0.7 13.8±0.8 13.4±0.9 Control 13.9±1.1 7.8±0.7*# 7.6±0.6*# 7.2±0.6*#Post 13.6±1.2 10.6±0.9*#△ 10.3±1.0*#△ 10.0±1.1*#△Sevo 13.9±0.8 10.9±0.6*#△ 10.8±0.6*#△ 10.5±0.7*#△DMSO 13.8±1.0 7.6±0.8*# 7.3±0.5*# 7.0±0.7*#PD 13.6±0.9 7.4±1.2*# 7.2±1.3*# 7.0±1.2*#Post+PD 13.9±1.1 7.9±1.0*# 7.8±1.1*# 7.6±0.9*#Sevo+PD 13.8±0.9 8.1±1.0*# 7.7±1.3*# 7.3±0.9*#HR/beats·min-1 Sham 306±15 304±14 301±15 297±17 Control 304±13 250±23*# 247±21*# 245±18*#Post 296±10 263±21*# 260±19*# 258±19*#Sevo 303±12 261±16*# 257±15*# 256±10*#DMSO 301±17 249±18*# 245±16*# 241±15*#PD 298±13 246±25*# 243±21*# 239±18*#Post+PD 303±15 254±16*# 252±15*# 248±14*#Sevo+PD 302±11 252±14*# 249±10*# 246±11*#

Fig 1Tab 2 infarct size of each group(%，±s，n=6)

Tab 2 The percentage of infarct size of myocardium at the end of reperfusion(±s，%)

Tab 2 The percentage of infarct size of myocardium at the end of reperfusion(±s，%)

Infarct size was determined using 1%triphenyltetrazolium chloride staining，as described in the methods section.In each group，six hearts were used，*P＜0.05 vs control

40.3±4.2 42.8±5.3 39.5±4.6 38.4±5.4 Control Post Sevo DMSO PD Post+PD Sevo+PD 41.7±5.1 22.7±3.2* 24.1±3.5*

Fig 2 Western blot analysis(ˉx ± s)

七氟烷后處理可能同其他鹵類吸入麻醉藥一樣通過抑制缺血/再灌注心肌早期的異?；顒?，以及激活某些信號通路，減輕調(diào)理介質(zhì)的失調(diào)產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)七氟烷后處理可以誘導(dǎo)ERK1/2的活性升高，ERK1/2的抑制劑 PD98059抑制了ERK1/2的活性，同時抵消了七氟烷后處理的心肌保護(hù)效果，證實ERK傳導(dǎo)通路在七氟烷后處理的心肌保護(hù)中發(fā)揮著重要的作用。在對心肌保護(hù)機(jī)制的研究中，ERK和PI3K被視為心肌保護(hù)補(bǔ)救激酶途徑得到了廣泛的研究。巧合的是，預(yù)處理和后處理保護(hù)機(jī)制中都包含了這兩種蛋白激酶的信號傳導(dǎo)通路，看起來這兩種心肌保護(hù)方法在心肌缺血/再灌時可能共享了某種信號通路，這條通路也可能就是各種心肌保護(hù)方法潛在的共用靶點，然而，在利用不同的模型對不同種屬動物的研究中，ERK和PI3K介導(dǎo)心肌保護(hù)的作用仍備受爭議。

ERK在1990年首次被描述為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，即被各種胞外信號包括胰島素和神經(jīng)生長因子磷酸化的酪氨酸［9］。大多數(shù)的研究證明ERK1/2是預(yù)處理和后處理產(chǎn)生心肌保護(hù)作用重要的信號通路，但仍存在爭議。Krolikowski實驗組利用在體兔缺血/再灌模型，用1.0 MAC異氟烷后處理研究發(fā)現(xiàn)，在第1個15 min的再灌注期間，利用PD98059抑制ERK1/2或者利用LY-294002抑制PI3K，都會使異氟烷后處理的心肌保護(hù)作用喪失，認(rèn)為這兩條通路在異氟烷后處理的心肌保護(hù)作用中都起著重要的作用［10-11］。Darling 等［12］利用離體兔的缺血/再灌注模型證實缺血后處理的心肌保護(hù)作用依賴 ERK傳導(dǎo)通路的激活而非 PI3K，而 Zhu等［13］利用在體鼠缺血后處理模型，認(rèn)為缺血后處理的心肌保護(hù)作用是通過PI3K傳導(dǎo)通路而不依賴ERK。還有一些學(xué)者認(rèn)為［14-16］這兩條傳導(dǎo)通路都介導(dǎo)了預(yù)處理和后處理的心肌保護(hù)，以上研究結(jié)果的異同可能與采用的實驗條件和動物模型不同有關(guān)。目前尚未見七氟烷后處理心肌保護(hù)機(jī)制關(guān)于ERK1/2信號通路研究的文獻(xiàn)報道，本實驗對大鼠離體心臟灌注模型用3.0%七氟烷后處理，發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注15 min后ERK1/2的活性增加，七氟烷誘導(dǎo)ERK1/2的活性進(jìn)一步加強(qiáng)，ERK1/2的抑制劑PD98059抵消了七氟烷誘導(dǎo)的心肌保護(hù)效果，證實ERK1/2是七氟烷后處理誘導(dǎo)心肌保護(hù)一條重要的信號通路。ERK是多條信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一些研究還顯示在心肌肥大、持續(xù)性心律失常等病理生理過程中，可能通過激活ERK等信號通路參與心肌結(jié)構(gòu)的重塑過程［17-18］。本實驗盡管顯示 ERK1/2在心肌保護(hù)中起著重要的作用，但其介導(dǎo)心肌保護(hù)的具體機(jī)制目前仍不清楚，七氟烷和異氟烷具有相似的藥理特性，它們誘導(dǎo)的心肌保護(hù)機(jī)制應(yīng)具有相似的信號通路，這需要進(jìn)一步的研究證實。

p70S6K是ERK1/2的下游靶點，對細(xì)胞的生長和存活起著關(guān)鍵性的作用。p70S6K可以通過調(diào)節(jié)促凋亡蛋白BAD的活性抗細(xì)胞凋亡來介導(dǎo)心肌保護(hù)［19］。本實驗發(fā)現(xiàn)，ERK1/2的下游靶點 p70S6K的活性隨著ERK1/2活性的增加而增加，ERK1/2的抑制劑也可部分抑制p70S6K的活性，揭示七氟烷后處理可能通過激活ERK1/2/p70S6K這條抗細(xì)胞凋亡信號通路來介導(dǎo)心肌保護(hù)。但本實驗只能說明七氟烷后處理可以提高p70S6K的活性，其心肌保護(hù)作用是否通過這條通路尚需進(jìn)一步證實，而且通過兩條條帶對比發(fā)現(xiàn)，盡管PD98059完全抑制了ERK1/2的活性，p70S6K的活性卻并沒被完全抑制，說明p70S6K的活化可能還存在其他的通路調(diào)節(jié)。

我們還發(fā)現(xiàn)，復(fù)灌15 min時，同假手術(shù)組比，缺血/再灌注心肌細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)增加，說明缺血/再灌注損傷可使組織細(xì)胞的ERK1/2迅速激活，ERK1/2可能作為早期細(xì)胞內(nèi)信號參與了細(xì)胞對這一應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，因此缺血/再灌注時ERK1/2活性的增加可能是細(xì)胞缺血/再灌注損傷的修復(fù)過程，是細(xì)胞存活的保護(hù)性機(jī)制，對于經(jīng)歷了缺血/再灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用，七氟烷通過進(jìn)一步增強(qiáng)ERK1/2活性加強(qiáng)了這種保護(hù)效果。同時，條帶還顯示缺血后處理同七氟烷后處理一樣使ERK1/2和p70S6K的活性進(jìn)一步加強(qiáng)，ERK1/2的抑制劑PD98059抑制了ERK1/2的活性，同時抵消了缺血后處理的心肌保護(hù)效果，證實ERK傳導(dǎo)通路在缺血后處理的心肌保護(hù)中也發(fā)揮著重要的作用。揭示兩者可能存在相似的心肌保護(hù)機(jī)制，ERK1/2可能是這兩種保護(hù)途徑的共同靶點。

本實驗也發(fā)現(xiàn)七氟烷能明顯提高再灌期心肌的冠狀動脈血流量，對改善再灌期無復(fù)流現(xiàn)象起到積極作用，這和我們先前的研究結(jié)果一致［7］。心肌無復(fù)流現(xiàn)象是缺血/再灌注損傷的一個重要特征，再灌期缺血區(qū)微血管堵塞得不到充分的灌注，冠狀動脈血流量下降，冠狀動脈血流量的改變可影響再灌注損傷的發(fā)展，冠狀動脈擴(kuò)張劑能提高缺血/再灌心肌的功能［20］。鑒于揮發(fā)性麻醉藥具有降低冠狀動脈阻力，明顯增加冠狀動脈血流量的藥理特性，許多研究認(rèn)為揮發(fā)性麻醉藥的心肌保護(hù)作用與其增加心肌冠狀動脈血流量有關(guān)［21］。七氟烷可擴(kuò)張冠狀動脈，冠狀動脈竊血的危險性明顯小于異氟烷，吸入高濃度七氟烷不減少冠狀動脈血流量，Kehl等［22］證實1.5MAC七氟烷并未引起犬冠狀動脈血流的異常分布，即所謂的“冠脈竊血”，而是優(yōu)先增加了冠狀動脈側(cè)支血管的血流量，Ca2+激活K+通道是其機(jī)制之一。Harkin等［23］認(rèn)為七氟烷對冠狀動脈血管的擴(kuò)張作用不同于氟烷與異氟烷，七氟烷不影響舒張期冠狀動脈流速。本實驗只是對復(fù)灌30 min后的冠狀動脈血流量進(jìn)行了統(tǒng)計，并沒做這方面更早期的研究，但發(fā)現(xiàn)信號通路ERK的抑制劑PD98059不僅抵消七氟烷的心肌保護(hù)效果，而且也阻斷了七氟烷提高冠狀動脈血流量的能力，說明再灌注早期的冠狀動脈血流量的恢復(fù)可能與七氟烷的藥理特性有關(guān)，而后期的冠狀動脈血流量的增加可能只是與其能減輕心肌細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、改善心肌微循環(huán)這種間接的心肌保護(hù)作用有關(guān)。

3.0 %的七氟烷后處理可誘導(dǎo)ERK1/2的活性增加，改善缺血/再灌心肌的收縮和舒張功能，減少心肌梗死面積，具有明顯的心肌保護(hù)作用。近年來，隨著器官移植、體外循環(huán)下心臟外科手術(shù)的廣泛開展，缺血/再灌注損傷已成為臨床麻醉面臨的一種常見的病理生理變化。七氟烷等吸入麻醉藥對缺血/再灌注損傷心肌保護(hù)的內(nèi)在機(jī)制是復(fù)雜的、多重的，仍需大量的動物實驗和臨床試驗進(jìn)一步探索。

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