PCR-DGGE法研究Sludge bio-membrane(SB)系統(tǒng)中反硝化聚磷菌的變化

劉暉，孫彥富，周康群，顧雪婷，劉潔萍，陳捷美

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 環(huán)境科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510225)

控制并降低污水中的氮、磷濃度是防止水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要措施，因此，生物同步脫氮除磷技術(shù)是目前國內(nèi)外污水處理研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。在污水處理廠的實(shí)際運(yùn)行過程中發(fā)現(xiàn)有一類反硝化聚磷菌(即DPB)，其在厭氧條件下吸收有機(jī)物同時(shí)合成為細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)物PHB(聚β-羥基丁酸)并釋放正磷酸鹽，而在缺氧環(huán)境下利用硝酸鹽作為電子受體，進(jìn)行反硝化作用的同時(shí)超量聚磷，使除磷和脫氮這2個(gè)生物過程在缺氧環(huán)境下由同一類微生物一并完成。由此開發(fā)的工藝不僅降低了脫氮對(duì)碳源的需要，而且可節(jié)省好氧聚磷所需能源和池容，此外，剩余污泥量也大大降低[1-3]，是一種低碳節(jié)能高效的新技術(shù)。目前，國內(nèi)反硝化聚磷的研究多利用 SBR反應(yīng)器在實(shí)驗(yàn)室采用人工模擬廢水進(jìn)行研究[4-6]，但是，利用連續(xù)流的SB活性污泥與生物膜復(fù)合系統(tǒng)(SB系統(tǒng))、采用實(shí)際的污水來進(jìn)行同步反硝化聚磷的研究報(bào)道較少。國內(nèi)外對(duì)菌富集過程中反硝化聚磷菌種類的變化研究很少，僅周康群等[4-6]對(duì)反硝化聚磷SBR系統(tǒng)中的微生物組成采用傳統(tǒng)的微生物方法進(jìn)行了研究。迄今為止，采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)SB系統(tǒng)在富集過程中微生物種群變化的系統(tǒng)研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用SB系統(tǒng)富集反硝化聚磷菌，以3個(gè)處理階段的泥水混合液為研究對(duì)象，進(jìn)行了微生物種群變化的跟蹤與研究。為研究SB系統(tǒng)中的種群多樣性及其作用微生物學(xué)機(jī)理，從運(yùn)行不同時(shí)期裝置中提取污水混合液，利用平板分離法和 PCR-DGGE法同步跟蹤不同馴化富集階段反硝化聚磷菌種群的變化情況，以便為反硝化聚磷工藝富集功能菌株及機(jī)理的進(jìn)一步研究提供參考，為傳統(tǒng)的脫氮除磷工藝的改良、新工藝的開發(fā)與應(yīng)用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)反應(yīng)裝置

研究采用Sludge bio-membrane(SB)系統(tǒng)試驗(yàn)裝置見圖1。進(jìn)水流量為1 m3/d，各處理單元的操作分別為：(1) 厭氧活性污泥釋磷區(qū)：水力停留時(shí)間(HRT)為3.3 h，氧化還原電位(ORP)小于-100 mV；(2) 快速沉淀區(qū)：HRT為0.32 h；(3) 生物膜區(qū)：HRT為2.2 h，ORP大于+200 mV；(4) 兼性脫氧區(qū)：HRT為0.6 h，ORP小于+50 mV；(5) 缺氧活性污泥反硝化聚磷區(qū)：HRT為2.7 h，ORP為0～-100 mV；(6) 微曝氣區(qū)：HRT為0.15 h；(7) 沉淀區(qū)：HRT為0.3 h。

1.2 供試材料

1.2.1 試驗(yàn)污水

試驗(yàn)污水來自廣州市某污水處理廠的實(shí)際污水,其水質(zhì)情況見表1。

表1 試驗(yàn)污水成分Table 1 Composition of sewage wastewater

圖1 活性污泥與生物膜復(fù)合系統(tǒng)Fig.1 Activated sludge and bio-membrane combined system

1.2.2 Sludge bio-membrane(SB)同步脫氮除磷系統(tǒng)的運(yùn)行方案

取自運(yùn)行良好污水處理廠A2/O厭氧段活性污泥。將種泥與表 1中的試驗(yàn)污水混合(ρ(MLSS)=3.5~4.0 g/L),以生物膜區(qū)氨氧化反應(yīng)后產(chǎn)生的硝酸鹽為電子受體富集反硝化聚磷菌。運(yùn)行方案分3個(gè)階段，先分段運(yùn)行后連續(xù)運(yùn)行。

第1階段為膜硝化池的啟動(dòng)階段。目的是對(duì)系統(tǒng)中的硝化菌進(jìn)行富集從而將污水中的氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮，為后2階段富集反硝化聚磷菌提供硝酸鹽氮的電子受體。將運(yùn)行良好的廣州瀝滘污水廠 A2/O工藝好氧段活性污泥與廣州某污水處理廠污水混合，ORP控制在80~100 mV，共運(yùn)行3月。

第2階段為反硝化聚磷菌的富集、設(shè)備調(diào)試階段。該階段的目的是：(1) 去除常規(guī)的反硝化菌(僅有反硝化作用而無聚磷作用)；(2) 通過對(duì)厭氧釋磷池和同步反硝化吸磷池交替運(yùn)行，利用接觸氧化池產(chǎn)生的硝酸鹽為電子受體，對(duì)反硝化聚磷菌進(jìn)行選擇和富集，該段是整個(gè)試驗(yàn)的關(guān)鍵。當(dāng)?shù)?階段的好氧膜硝化池中氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮的轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在90%以上后，設(shè)備進(jìn)入第2階段，即同時(shí)啟動(dòng)厭氧釋磷區(qū)、快速沉淀區(qū)、好氧生物膜區(qū)、兼性脫氧區(qū)、缺氧反硝化聚磷菌區(qū)、微曝氣區(qū)和二次沉淀區(qū)。其過程為：好氧釋磷區(qū)(3.30 h)→快速沉淀區(qū)(0.32 h)→好氧生物膜區(qū)(2.20 h)→兼性脫氧區(qū)(0.20 h)→缺氧反硝化聚磷區(qū)(2.70 h)→微曝氣區(qū)(0.15 h)→二次沉淀區(qū)(0.34 h)方式運(yùn)行，初始污泥質(zhì)量濃度控制在2.0~2.5 g/L，缺氧ORP為-100~-120 mV，厭氧ORP為-150~-220 mV，共運(yùn)行6月。

第3階段為體系的穩(wěn)定階段。目的是：反硝化聚磷菌富集到一定量后，進(jìn)一步保持體系的穩(wěn)定性，裝置共運(yùn)行40 d。

當(dāng)?shù)?階段運(yùn)行到39 d時(shí)，出水TP質(zhì)量濃度為0.65 mg/L(＜1.00 mg/L)，總氮質(zhì)量濃度為 12.6 mg/L(＜15.0 mg/L)，氨氮質(zhì)量濃度為3.8 mg/L(＜5.0 mg/L)，COD質(zhì)量濃度為34 mg/L(＜50 mg/L)，均低于GB18918—2002標(biāo)準(zhǔn)的要求。系統(tǒng)出水TP、總氮、氨氮、COD濃度變化幅度都較小，由此進(jìn)一步說明體系進(jìn)入穩(wěn)定運(yùn)行。

本試驗(yàn)采用第2階段開始和第3階段末期反硝化聚磷區(qū)的污泥(此時(shí)硝酸鹽去除率高達(dá) 90.26%，磷酸鹽的去除率高達(dá) 92.31%)為研究種泥，將其分離純化后的純菌株作為研究對(duì)象。

1.2.3 聚磷菌培養(yǎng)液

無水乙酸鈉 5.0 g，KH2PO40.025 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·H2O 0.2 g，(NH4)2SO42.0 g，微量元素 1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 反硝化聚磷菌株的分離

將 1.2.2中的研究種泥接種于牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基，將最佳稀釋度平板上單一菌落經(jīng)過平板劃線純化得單菌株，用甘油混勻密封冷藏。

1.3.2 同步反硝化聚磷菌株顯微形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)

將幼齡菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在100×10倍光學(xué)顯微鏡下觀察顏色和形態(tài)。進(jìn)行產(chǎn)氨試驗(yàn)、硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還原、反硝化、異染粒、PHB染色等主要生化特性[7]試驗(yàn)。

1.3.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增、基因序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建

對(duì)獲得的培養(yǎng)物進(jìn)行離心收集沉淀，用 TE緩沖液(pH=8.0)洗滌，通過溶菌酶裂解和凍融步驟裂解細(xì)胞，以 SDS和酚/氯仿提取基因組 DNA。16S rRNA基因擴(kuò)增采用寡聚核苷酸引物27 f和1522 r。PCR擴(kuò)增程序：于94 ℃預(yù)變性4 min，于94 ℃變性1 min，于55 ℃復(fù)性1 min，于72 ℃延伸2 min，30次循環(huán)，最后于72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。所得 16S rDNA基因序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST序列的相關(guān)性搜索[8-9]。同時(shí)，利用相關(guān)種屬的16S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列對(duì)排用CLUSTAL X1.83 進(jìn)行多序列匹配排列，進(jìn)化樹的構(gòu)建用Neighbour-joining方法。進(jìn)化樹分枝模式的穩(wěn)定性用MEGA 4.0進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)1 000次，計(jì)算各分支的支持度。

1.3.4 PCR-DGGE的試驗(yàn)過程

(1) 樣品 DNA的制備。采用修改后的 Bead-Beating法[10]，樣品中加入20 mL抽提緩沖液(0.1 mol/L Tris·Cl，0.1 mol/L EDTA-Na2，0.2 mol/L NaCl，1%PVP，2% CTAB，pH=8.0)，浸泡 30 min，超聲波 15 min，加入10 mg/mL的溶菌酶，于37 ℃振蕩45 min。加入1.5 mL 20%SDS，65 ℃水浴1 h。離心后收集上清。上清用酚、氯仿、異戊醇(體積比為25:24:1)抽提3次，并加入終濃度為0.3 mol/L的NaAc(pH=5.2)及0.6倍NaAc溶液體積的異丙醇，于室溫沉淀1 h。轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，離心20 min，收集沉淀，并用70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50 μL TE中。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

(2) 16S rDNA-V3區(qū)擴(kuò)增。將樣品分別稀釋50倍后進(jìn)行 16SrDNA-V3區(qū)擴(kuò)增。引物對(duì)為 F357(含 GC夾子)：5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG-GGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG3’，R518：5’ATTACCGCGGCTCGCTGG 3’。25 μL 的反應(yīng)體系包含 H2O 0.25 μL，10×Buffer(含 2.0 mol/L MgCl2)2.0 μL，dNTP(10 mol/L) 1.0 μL，F(xiàn)338(10 μmol/L)1.0 μL，R518(10 μmol/L)1.0 μL，Taq(5 U/μL) 0.1 μL和模板DNA 1.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋河?4 ℃預(yù)變性4 min；于94 ℃變性0.5 min；于52 ℃復(fù)性1 min；于72 ℃延伸0.5 min；30次循環(huán)，于72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

(3) DGGE的實(shí)驗(yàn)過程。DGGE采用 BIO-RAD DGGE電泳儀。聚丙烯酰胺凝膠濃度為 8%，變性梯度為35%~65%(100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺)，電泳條件為：60 ℃，180 V，電泳5 h。0.04‰的 Goldview染液 30 min后用凝膠成像系統(tǒng)(GDS-8000)照相。

(4) DNA的回收和PCR擴(kuò)增測(cè)序。將DGGE切膠回收所得的條帶中加入適量的無菌水于 4 ℃浸泡 24 h，用作模板使用。將樣品進(jìn)行16SrDNA-V3區(qū)擴(kuò)增。引物對(duì)為 F338：5’ATTACCGCGGCTCGCTGG 3’，R518：5’ATTACCGCGGCTCGCTGG 3’。25 μL 的反應(yīng)體系包含H2O 0.25 μL，10×Buffer(含2.0 mmol/L MgCl2)2.0 μL，dNTP(10 mmol/L)1.0 μL，F(xiàn)338(10μmol/L)1.0 μL，R518(10 μmol/L)1.0 μL，Taq(5 U/μL)0.1 μL和模板DNA 1.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋河?4 ℃預(yù)變性5 min；于94 ℃變性30 s；于55 ℃復(fù)性40 s；于72 ℃延伸40 s；30次循環(huán)，于72 ℃延伸7 min，測(cè)序由上海英駿生物公司進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 利用微生物分離和純化的結(jié)果

在第2和第3階段分別分離出單菌株17株和11株。結(jié)合細(xì)菌的主要生理生化指標(biāo)[7]和16S rDNA測(cè)序鑒定結(jié)果見表2。

從表2可以看出：第2階段的細(xì)菌主要為棒狀桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、莫拉氏菌屬、葡萄球菌屬、副球菌屬等7種，第3階段的細(xì)菌主要為組成為不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、副球菌屬4種，即富集后系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌種類在減少，而周康群等[4-5]在SBR反應(yīng)器中分離到的反硝化聚磷菌以假單胞菌屬、棒狀桿菌屬為主，腸桿菌科和葡萄球菌屬次之。羅寧等[6]在A2/O-SBR反應(yīng)器中分離到的假單胞菌屬、莫拉氏菌屬、腸桿菌科細(xì)菌、氣單胞菌屬以及不動(dòng)桿菌屬與生物反硝化脫氮和生物除磷密切相關(guān)，占全部菌株的66.16%。導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生差異的原因是：試驗(yàn)采用Sludge bio-membrane (SB)同步脫氮除磷系統(tǒng)，進(jìn)水水質(zhì)是污水處理廠的實(shí)際污水，廢水中的碳源成分復(fù)雜；而羅寧等[6]采用實(shí)驗(yàn)室自配水樣，以醋酸鈉為主要碳源；此外，運(yùn)行條件不同，因此，活性污泥系統(tǒng)內(nèi)微生物組成和數(shù)量存在一定的差異。這說明反應(yīng)器中微生物種群組成和變化反映了生物脫氮除磷體系運(yùn)行狀況。

表2 SB同步脫氮除磷系統(tǒng)不同階段中主要的細(xì)菌數(shù)量Table 2 Main bacteria of SB simultaneously nitrogen and phosphorus removal system during different stages 個(gè)

2.2 采用PCR-DGGE分析SB系統(tǒng)微生物的多樣性

2.2.1 DGGE圖譜分析

圖2中的樣品分別取自第2階段的開始(即反硝化聚磷菌富集前，泥樣 A)和第 3階段的末期(即富集反硝化聚磷菌，泥樣B)，從圖2可知：泥樣B的DGGE圖譜在某些位置與泥樣A的比較接近，但在某些位置存在著一些差異。在樣品A中a，b，c，d和e條帶較亮，條帶較多這說明富集前菌種豐富，不同條帶間的位置較遠(yuǎn)而且很亮，說明菌種之間的差異比較明顯，充分顯示了裝置中微生物的多樣性。分析其原因是由于富集前種泥取自A/A/O工藝厭氧池，A/A/O工藝為一個(gè)單泥系統(tǒng)，具有豐富的微生物種群，主要有聚磷菌、反硝化菌等兼性厭氧菌。

圖2 DGGE圖譜Fig.2 Profile of DGGE

經(jīng)過富集培養(yǎng)后，樣品B中的b，c和d條帶存在，而且較亮，但是，a和e條帶消失，這說明經(jīng)過一段時(shí)間的富集培養(yǎng)，水體中占優(yōu)勢(shì)的微生物種群減少了2種，微生物的多樣性呈下降趨勢(shì)。這說明富集的方式有利于反硝化聚磷菌的生長(zhǎng)。

2.2.2 代表?xiàng)l帶的回收測(cè)序和進(jìn)化分析

選取較有代表性的條帶a，b，c，d和e切膠回收DNA后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物直接測(cè)序。使用GenBank的BLAST程序?qū)⒏患昂蟮?條序列與數(shù)據(jù)庫中已登錄的序列進(jìn)行同源性比較,采用Clustal W(Versionl.8)進(jìn)行多序列匹配排列，選取核酸數(shù)據(jù)庫中的序列，用Neighbour-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)化樹分枝模式的穩(wěn)定性用 MEGA4.0軟件進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)1 000次，計(jì)算各分支的支持度，結(jié)合伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)和常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[7-10]的生理生化指標(biāo)為依據(jù)鑒定歸屬。結(jié)果如下：

(1) a和Flavobacterium sp.(黃桿菌屬)的親緣關(guān)系最接近，序列同源性為95%，黃桿菌屬[11-12]是革蘭陰性桿菌，直桿狀，端圓，寬度×長(zhǎng)度為(0.5~0.8) μm×(1.0~3.0) μm，非發(fā)酵型，在含碳水化物培養(yǎng)液內(nèi)的反應(yīng)一般不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，也有兼性厭氧型，菌落呈黃色或橙色而得名。有機(jī)化能營(yíng)養(yǎng)，接觸酶、氧化酶、磷酸酶均為陽性，細(xì)胞內(nèi)不含聚β-羥基丁酸鹽，有些菌株能還原硝酸鹽和亞硝酸鹽。同時(shí)，結(jié)合反應(yīng)器中硝酸鹽去除率高達(dá)90.26%，因此，a與Flavobacterium sp.(黃桿菌屬)最相似，是反硝化菌。

(2) b和Alcaligenes sp.DQ435021(產(chǎn)堿桿菌屬)的親緣關(guān)系最接近。通過對(duì)其基因進(jìn)行比對(duì)，序列的同源性為96%。產(chǎn)堿桿菌屬是革蘭陰性桿菌，化能異養(yǎng)型，能夠利用醋酸鈉為碳源，呼吸代謝為非發(fā)酵類型，具有好氧反硝化特性。有的在硝酸鹽或亞硝酸鹽存在，能通過厭氧呼吸進(jìn)行反硝化，硝酸鹽和亞硝酸鹽作為電子受體，從而產(chǎn)生氮?dú)鈁13]。鮑林林等[13-15]報(bào)道產(chǎn)堿菌屬表現(xiàn)出良好的反硝化吸磷效果。由此認(rèn)為b與產(chǎn)堿桿菌屬Alcaligenes sp.最相似，是反硝化聚磷菌。

(3) c與Paracoccus sp.(副球菌屬)最相似，序列的同源性為94%。副球菌屬球形，呈單個(gè)、成對(duì)或堆存在，直徑為(0.5~0.9) μm，不運(yùn)動(dòng)。當(dāng)硝酸鹽、亞硝酸鹽或氧化氮存在時(shí)，能以它們?yōu)殡娮邮荏w進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)，并且在厭氧條件下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽到氧化氮和N2，因此，表現(xiàn)為反硝化功能。同時(shí)氧化酶和接觸酶反應(yīng)呈陽性。

(4) d和Janthinobacterium sp. (紫色桿菌屬)親緣關(guān)系最為接近，序列的同源性為96%。紫色桿菌屬由于其菌落呈紫色而得名[16-17]，具有圓端的桿菌，稍彎曲，為革蘭氏陰性桿菌，無運(yùn)動(dòng)性，無莢膜。其生理特性為：既是氧化型又是發(fā)酵型，接觸酶陽性，吲哚陰性，磷酸酶陽性，還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，有時(shí)產(chǎn)生氣體，由胨產(chǎn)生氨即具有反硝化功能。但尚未報(bào)道是否具有反硝化聚磷功能，由此推斷得出d與Janthinobacterium sp.(紫色桿菌屬)最相似，同時(shí)是一種反硝化菌。

(5) e為赤細(xì)菌屬(Erythrobacter sp.)，序列的同源性為97%，由于其培養(yǎng)物及菌落呈橘黃色或粉色而得名，是一種光合細(xì)菌,具有營(yíng)養(yǎng)、凈化水體等作用[18]，多發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖密集區(qū)和海洋中。赤桿菌屬是革蘭氏陰性桿菌，好氧，化能異養(yǎng)型，兼性光能異養(yǎng)型?？衫玫奶荚礊椋捍姿猁}、丙酮酸鹽、丁酸鹽、谷氨酸鹽及葡萄糖。生長(zhǎng)需要維生素。最佳生長(zhǎng)溫度為 25~30℃；pH為7.0~8.0；需要1.7%~3.5% NaCl，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。由此推斷得出e與Erythrobacter sp.最相似，具有反硝化功能。

綜上所述，a應(yīng)歸屬于Flavobacterium sp.(黃桿菌屬，屬Flavobacteria)，b應(yīng)歸屬于Alcaligenes sp.(產(chǎn)堿桿菌屬 β-proteobacteria)，c應(yīng)歸屬于 Paracoccus sp.(副球菌屬，屬 α-proteobacteria)，d應(yīng)歸屬于Janthinobacterium sp.(紫色桿菌屬 β- proteobacteria)，e應(yīng) 歸 屬 于 Erythrobacter sp.(赤 細(xì) 菌屬α-proteobacteria)。其中：b和 c為反硝化聚磷菌，a和e為反硝化菌，d是反硝化菌，但其聚磷功能有待進(jìn)一步研究。

2.2.3 富集前后的群落結(jié)構(gòu)差異

在樣品A中a，b，c，d和e條帶較亮，分別鑒定為黃桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬、赤細(xì)菌屬，其中產(chǎn)堿桿菌屬、副球菌屬為反硝化聚磷菌，紫色桿菌屬、黃桿菌屬、赤細(xì)菌屬為反硝化菌。這說明反硝化聚磷菌存在于A/A/O工藝的厭氧池中，只是由于A/A/O工藝的運(yùn)行方式不能使其成為優(yōu)勢(shì)種群，也有可能是反硝化聚磷菌在A/A/O工藝運(yùn)行中體現(xiàn)了其好氧聚磷的特點(diǎn)。

B水樣中的代表?xiàng)l帶為3條，分別為黃桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬。從圖2可以看出：7種菌經(jīng)過富集后減少為4種，這顯示SB同步脫氮除磷系統(tǒng)富集后微生物的多樣性有所下降。這是因?yàn)橥ㄟ^富集運(yùn)行后，采用反硝化聚磷工藝給聚磷菌提供了厭氧缺氧交替的環(huán)境，而且控制污水中 COD質(zhì)量濃度。在

厭氧釋磷后經(jīng)過沉淀大大降低污水中COD質(zhì)量濃度，致使缺氧池進(jìn)水COD的質(zhì)量濃度低于50 mg/L，消除殘余 COD對(duì)反硝化聚磷菌的影響，限制了大部分常規(guī)反硝化菌的生長(zhǎng)，因此減少了污泥中專職的反硝化菌，從而使僅具有反硝化功能的赤細(xì)菌屬被淘汰，種群多樣性隨之降低[5]，但反硝化聚磷功能的產(chǎn)堿桿菌屬、副球菌屬仍然存在，充分說明系統(tǒng)的富集方式有利于反硝化聚磷菌的生存。但另一方面是富集后d條帶(紫色桿菌屬)很亮，反應(yīng)池中硝酸鹽去除率高達(dá)90.26%，磷酸鹽的去除率高達(dá)92.31%，紫色桿菌屬的生理生化指標(biāo)確定其為反硝化菌，而且從圖3所示的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知產(chǎn)堿桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬3種菌屬的親緣關(guān)系接近，而黃桿桿菌屬和赤細(xì)菌屬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此，紫色桿菌屬的聚磷功能有待于進(jìn)一步確定。

圖3 SM系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)菌群的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenic tree construction of dominate bacteria in SM system

2.2.4 PCR-DGGE法與平板法的比較

從表2可以看出：富集后的細(xì)菌主要為不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、副球菌屬4種。而通過PCR-DGGE分析后可知：富集后主要的反硝化聚磷菌為產(chǎn)堿桿菌屬、副球菌屬2種，僅有副球菌屬為2種方法同時(shí)獲得的唯一菌屬。這是因?yàn)槔闷桨宸蛛x技術(shù)，培養(yǎng)基單一，而且受到培養(yǎng)條件的限制，得到的菌種類有限；而利用 DGGE-PCR技術(shù)得到的菌種多樣、豐富，但是由于該方法也有其自身的局限性, 有些平板分離后的菌種仍無法被顯示, 因此，二者的試驗(yàn)結(jié)果重合度并不高。其他菌種對(duì)系統(tǒng)反硝化除磷能力的貢獻(xiàn)還有待于進(jìn)一步深入研究。

副球菌屬是唯一通過2種辦法獲得確認(rèn)反硝化聚磷功能的菌株。周康群等[4]采用傳統(tǒng)方法從SBR反應(yīng)器中分離的反硝化聚磷菌(DPB)以假單胞菌屬、棒狀桿菌屬為主，腸桿菌科和葡萄球菌屬次之。蔣軼鋒等[19]采用 PCR-DGGE技術(shù)分離的 DPB為 gamma-Proteobaccteria亞綱中的 Chromatiaceae屬(相似性98%)，Ahn等[20]采用PCR-DGGE技術(shù)分離的DPB主要有紅環(huán)菌屬 Rhodocyclus sp.(96%相似度)和Dechlorimonas sp. (97%同源性)，它們都是屬于變形菌。然而，通過 FISH只發(fā)現(xiàn)了紅環(huán)菌屬。Tsuneda等[21-22]從厭氧/好氧 SBR池中污泥分離到的 DPB為Thauera mechernichensis (83%相似度)和固氮弧菌屬Azoarcus tolulyticus (83%相似度)，其都屬于紅環(huán)菌屬。副球菌屬是國內(nèi)外首次報(bào)道的反硝化聚磷菌。

2.2.5 PCR-DGGE法與16S rDNA克隆法的比較

本實(shí)驗(yàn)中采用DGGE的結(jié)果檢測(cè)到的細(xì)菌有：黃桿菌屬(Flavobacteria綱，為bacteroidetes門)，產(chǎn)堿桿菌屬(β-proteobacteria 綱)，副球菌屬(α-proteobacteria綱)，紫色桿菌屬(β-proteobacteria 綱)，Erythrobacter sp.(赤 細(xì) 菌 屬 α-proteobacteria)即 以 變 形 門(proteobacteria)為主，此與焦中志等[14,23]的研究結(jié)果一致。焦中志等[14]采用平板分離法發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬和產(chǎn)堿菌屬的脫氮除磷效果最好，采用DGGE法發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中反硝化聚磷菌優(yōu)勢(shì)種群可主要分為7個(gè)群, 分別是 Anaerolineae(屬), Actinobacteria(放線菌綱),Bacteroidetes (擬桿菌門)，TM7，α-proteobacteria(變形綱)，δ-proteobacteria(變形綱)和 γ-proteobacteria(變形綱)菌群，其中，Actinobacteria(放線菌綱)和γ-proteobacteria為優(yōu)勢(shì)的反硝化聚磷菌。而本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過富集培養(yǎng)以后產(chǎn)堿桿菌屬保持優(yōu)勢(shì)，也從另一方面證明了產(chǎn)堿桿菌屬為反硝化聚磷菌。王海燕等[23]采用16S rDNA克隆文庫方法對(duì)高效同步脫氮除磷系統(tǒng)的細(xì)菌進(jìn)行了多樣性研究。結(jié)果表明：系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群為Proteobacteria類群(變形菌類群)，占55.17%；細(xì)菌類群優(yōu)勢(shì)順序?yàn)?γ-Proteobacteria類群(34.48%)，Bacteroidetes類群(似桿菌類群，20.69%)，β-Proteobacteria類群(12.07%)，Candidate division TM7類 群 (12.07%)， α-Proteobacteria 類 群 (5.17%)，δ-Proteobacteria 類群(3.45%)，F(xiàn)irmicutes類群(厚壁菌類群，3.45%)，Candidate division OP11類群(1.72%)和Planctom ycetes類群(浮霉?fàn)罹惾? 1.72%)。因?yàn)榭寺》ㄋ@得的基因序列非常短，因此，很多細(xì)菌無法鑒定到屬，故研究系統(tǒng)內(nèi)的微生物全面但不明確，而采用 PCR-DGGE法獲得的基因序列長(zhǎng)達(dá)幾百，因此，細(xì)菌明確，但是，因?yàn)橹荒茉谀承┹^亮的光帶上才能提取基因序列，因此，無法全面反映系統(tǒng)中微生物的多樣性，故采用不同的研究方法、從不同的研究角度才能全方位了解系統(tǒng)內(nèi)部微生物的多樣性和復(fù)雜性。

無論采用PCR-DGGE研究SB同步脫氮除磷系統(tǒng)和SBR池中的優(yōu)勢(shì)菌，以及采用16S rDNA克隆文庫方法研究高效同步脫氮除磷系統(tǒng)的細(xì)菌，都以變形門(proteobacteria)占優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

(1) 通過平板法分離到的微生物主要為棒狀桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、莫拉氏菌屬、葡萄球菌屬、副球菌屬共7種，富集后細(xì)菌主要為不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌科、副球菌屬 4種，即富集后系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌種類減少，與采用SBR池富集的反硝化聚磷菌種類不同。

(2) 采用DGGE法發(fā)現(xiàn)樣品富集前以黃桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬、赤細(xì)菌屬5種菌為主，富集后以產(chǎn)堿桿菌屬、副球菌屬、紫色桿菌屬3種屬為主，副球菌屬是唯一通過2種辦法獲得確認(rèn)反硝化聚磷功能的菌株，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

(3) Sludge bio-membrane(SB)同步脫氮除磷系統(tǒng)中采用PCR-DGGE法獲得的菌株與優(yōu)勢(shì)菌不同，16S rDNA克隆文庫方法獲得的菌株更為豐富，但是，proteobacteria門為主在脫氮除磷的系統(tǒng)中都占優(yōu)勢(shì)。

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