超臨界色譜拆分6種唑類手性農(nóng)藥

馮碩立,徐明仙,高偉亮,林春綿

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310032;2.杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工系,浙江 杭州 310018)

手性異構(gòu)體(對(duì)映體)的存在是自然界的一種普遍現(xiàn)象,在現(xiàn)有的農(nóng)藥品種中,分子中含有手性原子的化合物越來越多,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,市場(chǎng)上出售的農(nóng)藥化學(xué)品中約有30%～40%是具有手性的[1].目前主要的手性農(nóng)藥有:有機(jī)磷類殺蟲劑,擬除蟲菊酯類殺蟲劑,三唑類殺菌劑,?；被犷悮⒕鷦┑?手性農(nóng)藥對(duì)映體在生物環(huán)境中所表現(xiàn)出的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)存在很大的差異,例如三唑醇的4個(gè)光學(xué)異構(gòu)體殺菌能力完全不同,左旋體的藥效高于右旋體,毒性還比右旋體低.由于單一對(duì)映體農(nóng)藥具有高效低毒等特點(diǎn),使其在市場(chǎng)上的需求得到迅猛增長,利用對(duì)映體活性的不同進(jìn)行新的農(nóng)藥的開發(fā)具有廣闊的前景.目前,獲得單一對(duì)映體的技術(shù)主要有對(duì)映體選擇性合成與對(duì)映體分離.對(duì)映體選擇合成技術(shù)上困難很大且成本太高,因此手性農(nóng)藥對(duì)映體分離技術(shù)日益引起人們的關(guān)注[2-4].目前,HPLC,SFC等在手性對(duì)映體分離領(lǐng)域中均發(fā)揮著重要作用.其中,HPLC使用很普遍,又有大量的手性固定相(CSPs)可供選擇,是最常用的色譜分離技術(shù).但是HPLC也存在分析時(shí)間過長,分離效率不高等缺陷,而SFC(一種流動(dòng)相溫度、壓力均高于或略低于臨界點(diǎn)的色譜技術(shù))與常規(guī)的HPLC相比,具有體系的粘度低、擴(kuò)散和傳質(zhì)速率高等優(yōu)點(diǎn),引起了許多學(xué)者的濃厚興趣.他們對(duì) HPLC和SFC做了一些對(duì)比研究[5,6],發(fā)現(xiàn)SFC的分離效率更高、分析時(shí)間更短,可以有效地彌補(bǔ)HPLC的不足.

三唑類農(nóng)藥作為一類高效殺菌劑,能有效保護(hù)谷物、大豆、水果等農(nóng)作物免受細(xì)菌侵害,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用非常廣泛[7].三唑類農(nóng)藥大多擁有手性,這對(duì)它們的生物活性產(chǎn)生了很大的影響.目前,人們使用HPLC拆分了很多三唑類農(nóng)藥,使用的手性固定相有多糖類、環(huán)糊精類、大環(huán)抗生素類手性固定相[8-10],但使用SFC拆分三唑類農(nóng)藥的文獻(xiàn)卻很少.本實(shí)驗(yàn)采用SFC在Chiralpak IB手性柱上拆分了三唑酮、戊唑醇、己唑醇、烯效唑、腈菌唑、惡醚唑6種三唑類農(nóng)藥,并分別考察了甲醇、乙醇、異丙醇三種醇類改性劑對(duì)手性分離結(jié)果的影響.

1 材料與方法

1.1 藥劑和試劑

三唑類農(nóng)藥(圖 1):腈菌唑、三唑酮、己唑醇、戊唑醇、烯效唑和惡醚唑.所有農(nóng)藥純度大于95%,溶解在乙醇中(由溫州一帆化工有限公司提供).

圖1 6種三唑類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of the six triazole fungicides

醇類改性劑:色譜甲醇、乙醇及異丙醇(天津四友).

液態(tài)CO2:干冰級(jí)CO2(杭州今工特種氣體有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

超臨界色譜型號(hào)為Thar SD-ASFC-2 system,配有UV/VIS-151紫外檢測(cè)器和Rheodyne 7410手動(dòng)進(jìn)樣閥(以上設(shè)備購自Thar Technologies,Pittsburgh,PA,USA).SFC系統(tǒng)控制軟件:superchrom software.

手性色譜柱:Chiralpak IB(250 mm×4.6 mm ID,5 μ m);手性選擇基團(tuán):鍵合在硅膠上的纖維素-(3.5-二甲基苯基氨基甲酸酯).

1.3 色譜條件和色譜參數(shù)計(jì)算

流動(dòng)相主體為超臨界CO2,改性劑有:甲醇、乙醇、異丙醇.流動(dòng)相流速:2.0 mL/min.SFC系統(tǒng)溫度:36℃.紫外檢測(cè)波長:230 nm.

色譜柱死體積(t0)用1,3,5-三叔丁基苯(tributylbenzene)測(cè)定:1.9 min.第一個(gè)洗脫峰的保留因子:k′1=(t1-t0)/t0,第二個(gè)洗脫峰的保留因子:k′2=(t2-t0)/t0.分離度:Rs=(t2-t1)/(W1+W2).其中t1和t2分別為第一個(gè)洗脫峰和第二個(gè)洗脫峰的保留時(shí)間;W1和W2分別是第一個(gè)洗脫峰和第二個(gè)洗脫峰的半峰寬.

2 結(jié)果與討論

如圖1所示,6種三唑類農(nóng)藥都擁有氯苯基和1,2,4-三唑基團(tuán),除了惡醚唑有兩個(gè)手性中心,4個(gè)對(duì)映體外,其他5種農(nóng)藥都只有1個(gè)手性中心,2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體.考慮到6種農(nóng)藥結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性,我們嘗試用一根手性柱(Chiralpak IB)在SFC上拆分這6種農(nóng)藥.

2.1 醇類改性劑的影響

由表1,2可知,除了惡醚唑,其他5種農(nóng)藥的拆分效果都比較理想,保留時(shí)間小于10 min,分離度大于1.當(dāng)醇類改性劑由異丙醇變?yōu)榧状紩r(shí),由于流動(dòng)相極性增強(qiáng),農(nóng)藥的保留時(shí)間縮短.而提高醇類改性劑的比例,也會(huì)增強(qiáng)流動(dòng)相的極性,農(nóng)藥的保留變?nèi)?同時(shí)還會(huì)降低對(duì)映體的分離度.使用同一種流動(dòng)相組合,6種農(nóng)藥的保留時(shí)間各不相同,由長到短依次為戊唑醇、惡醚唑、腈菌唑、己唑醇、烯效唑和三唑酮.其中己唑醇和烯效唑的分子結(jié)構(gòu)非常相似,保留時(shí)間也很接近.可能是由于兩種農(nóng)藥分子中苯環(huán)上氯原子取代個(gè)數(shù)的不同造成了兩者保留時(shí)間的微小差別.

表1 腈菌唑、三唑酮和己唑醇的拆分結(jié)果Table 1 Separation results of myclobutanil,triadimefon,hexaconazole

表2 戊唑醇、烯效唑和惡醚唑的分離結(jié)果Table 2 Separation results of tebuconazole,uniconazole,difenoconazole

己唑醇和腈菌唑的拆分效果最為理想,使用改性劑甲醇、乙醇或異丙醇都能使它們的對(duì)映體實(shí)現(xiàn)基線分離,在高濃度的改性劑條件下也能獲得很高的分離度.尤其是腈菌唑,當(dāng)甲醇的濃度提高到20%時(shí),分離度仍然有6.71,因此,在拆分這兩種農(nóng)藥時(shí),可以使用高濃度的改性劑以縮短其保留時(shí)間.兩種農(nóng)藥的最佳拆分條件分別為V(CO2)∶V(乙醇)=4∶1和 V(CO2)∶V(甲醇)=4∶1.

使用CO2和乙醇的流動(dòng)相組合可以順利拆開烯效唑和戊唑醇兩種農(nóng)藥,但卻不是最理想的選擇.以5%的甲醇作為改性劑,可以在10分鐘內(nèi)基線分離烯效唑的兩個(gè)對(duì)映體,分離度為2.3.用V(CO2)∶V(異丙醇)=9∶1的流動(dòng)相組合拆分戊唑醇,分離度也可達(dá)到1.85.值得一提的是,甲醇適合于拆分烯效唑,但卻無法拆開戊唑醇.而異丙醇正好相反.

三唑酮的兩個(gè)對(duì)映體在固定相上的保留能力非常接近,將乙醇和異丙醇作為改性劑時(shí),對(duì)映體分離度幾乎為0.最后,采用5%的甲醇基本實(shí)現(xiàn)了其兩個(gè)對(duì)映體的分離,分離度為1.06.

在HPLC上,惡醚唑的兩組對(duì)映體在Chiralcel OD上始終無法得到有效分離[11],周穎等在Chiralcel OJ柱上,使用V(正己烷)∶V(乙醇)=9∶1的流動(dòng)相分離了該農(nóng)藥的四個(gè)對(duì)映體[12].我們使用SFC,在Chiralpak IB柱上考察了三種醇類改性劑的拆分效果,三種改性劑都能拆開惡醚唑的第一組對(duì)映體,但只有乙醇才能拆開其第二組對(duì)映體.在3%到18%的改性劑比例區(qū)間內(nèi),我們考察了乙醇對(duì)手性分離的影響,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要的現(xiàn)象:隨著乙醇濃度的升高,第二組對(duì)映體的分離度先增加后減小,在乙醇濃度為10%時(shí)分離度達(dá)到最大值.V(CO2)∶V(乙醇)=9∶1的流動(dòng)相組合即為惡醚唑的最佳拆分條件.

2.2 手性拆分機(jī)理的探討

手性化合物在手性固定相上的拆分機(jī)理尚未被徹底闡明,對(duì)映體與手性固定相間存在著偶極-偶極、氫鍵-氫鍵、π-π作用和非手性作用(空間位阻作用)等作用力[13].對(duì)映異構(gòu)體與固定相發(fā)生作用時(shí)彼此會(huì)有差異,正是這由于三唑類農(nóng)藥與手性固定相之間的作用非常復(fù)雜,我們?cè)谶@里僅僅對(duì)其手性識(shí)別作用的可能性進(jìn)行初步探討.首先,三唑酮分子中的羰基(C=O)可以和手性固定相中的羰基(C=O)形成偶極-偶極作用,也可與固定相中的NH基團(tuán)形成氫鍵作用.己唑醇、戊唑醇、烯效唑分子中的羥基(OH)也能與固定相中的羰基(C=O)形成氫鍵作用.6種農(nóng)藥中的苯環(huán)都能與固定相中的芳香環(huán)形成π-π共軛作用.農(nóng)藥苯環(huán)上的氯原子具有很強(qiáng)的負(fù)電性,很可能會(huì)影響發(fā)生在固定相(NH基團(tuán))上的氫鍵作用.在農(nóng)藥分子在與固定相發(fā)生化學(xué)鍵作用的同時(shí),也可能受到固定相手性空腔的影響.

3 結(jié) 論

使用 SFC,以SC-CO2為流動(dòng)相,以甲醇、乙醇或異丙醇為流動(dòng)相改性劑,實(shí)驗(yàn)研究了6種唑類殺菌劑的手性分離.除了惡醚唑外,其他5種農(nóng)藥的手性對(duì)映體都獲得了有效拆分;流動(dòng)相改性劑的加入比例和種類都會(huì)對(duì)拆分結(jié)果產(chǎn)生影響;乙醇適合于拆分己唑醇、惡醚唑,甲醇適合拆分戊唑醇、三唑酮、腈菌唑,異丙醇則適合于分離烯效唑.通過實(shí)驗(yàn)和比較分析,最終得到了最佳拆分條件.

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