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    HPLC測定青藏高原不同地區(qū)藏藥手掌參中天麻素

    2011-05-26 07:17:48林鵬程
    中成藥 2011年5期
    關(guān)鍵詞:藏藥手掌青藏高原

    薛 楠, 薛 敬, 林鵬程

    (青海民族大學(xué)化生院,青海西寧 810007)

    手掌參GymnadeniaconopseaR.Br.又名佛手參、手參、掌參,是蘭科Orchidaceae手參屬一種多年生草本植物,因其地下根莖形似手掌而得名,主要生長在青藏高原海拔2 700~4 000 m范圍內(nèi)無污染的灌木叢中,為常用名貴藏藥[1-2]。手掌參味甘,性溫,具有增力生精、溫腎暖腎、大補元氣、安神增智等功效。尤其對陽痿、腎寒有益,具有很高的藥用價值,因而有“不老草”之稱[3-6]。天麻素是手掌參主要有效成分之一[7],現(xiàn)代藥理研究表明,天麻素具有鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗衰老、增加心腦血流量、改善學(xué)習(xí)記憶力等作用[8]。為了有效控制藥材的質(zhì)量[9],本實驗建立了青藏高原不同地區(qū)手掌參中天麻素含量的高效液相色譜測定方法。該方法快速、簡便、準確、重復(fù)性好,不僅適用于手掌參原藥材的質(zhì)量控制,還可供手掌參制劑借鑒。

    1 儀器與材料

    Agilent 1100高效液相色譜儀(配置手動進樣器,在線脫氣機,高壓二元梯度泵,恒溫柱溫箱,DAD檢測器,Agilent 1100色譜工作站);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);FZ102微型植物試樣粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。實驗用試劑甲醇為高效液相色譜專用試劑(山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠);水為自制三重蒸餾水;磷酸為AR級(北京紅星化工廠);天麻素對照品由本課題組分離鑒定,純度大于99% 。手掌參樣品系2009年9月采于青藏高原不同地區(qū),由青海民族大學(xué)藥學(xué)系林鵬程教授鑒定,樣品陰干后粉碎過80目篩,冷藏保存。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱 Hypersil ODS-2(4.6 mm ×250 mm,5 μm)柱;流動相甲醇-水(含0.04%的磷酸)=8∶92;體積流量1 mL/min;檢測波長222 nm;柱溫30℃,進樣量20 μL。該色譜條件下天麻素被洗脫且達到基線分離,保留時間為9.21 min(見圖1)。

    2.2 溶液配制

    精密稱取天麻素對照品3.50 mg置10 mL量瓶中,以甲醇溶解并定容,配制成對照品溶液。精密稱取手掌參樣品粉末1.0 g,加入50%的甲醇15 mL,熱回流提取2 h,抽濾,濾渣重復(fù)處理1次,合并濾液,濃縮后定容至25 mL量瓶中,過0.45 μm 濾膜,即得樣品溶液。

    2.3 線性關(guān)系

    精密量取天麻素對照品溶液適量,用甲醇準確稀釋成下列濃度:0.070、0.140、0.210、0.280、0.350 和0.420 g/L 的系列對照品稀釋液,取各稀釋液進樣20 μL,記錄峰面積。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),進樣量C(μg)為橫坐標(biāo),得天麻素的回歸方程為:A=512.91C+0.35,r=0.999 9。線性范圍為:1.400 ~8.400 μg。當(dāng)信噪比 S/N=3 時,天麻素的檢測限為0.32 ng。

    圖1 天麻素對照品(A)和手掌參樣品(B)HPLC圖1.天麻素

    2.4 精密度實驗

    精密吸取濃度為0.210 g/L的天麻素對照品稀釋液20 μL,在2.1項色譜條件下重復(fù)進樣5次,記錄峰面積,計算RSD為0.41%(n=5),表明儀器精密度良好。

    2.5 重復(fù)性實驗

    精密稱取手掌參樣品1.0 g共5份,分別按2.2項下方法制備成樣品溶液,然后在2.1項色譜條件下測定天麻素,計算得RSD為1.4%(n=5),表明方法重復(fù)性良好。

    2.6 穩(wěn)定性實驗

    取新配制的樣品溶液,分別在 0、2、4、6、8 h時進樣,測定天麻素的峰面積,計算得RSD為1.3%(n=5),表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.7 回收率實驗

    精密稱取已測定的手掌參(3#樣品)1.0 g共9份,分為3組,每組3份,分別添加低、中、高3種濃度的天麻素對照品液適量,按2.2項下方法操作,測得天麻素平均回收率(n=9)為99.14%,RSD 為0.69%。結(jié)果見表1。

    2.8 樣品測定

    取2.2項下制備的青藏高原不同地區(qū)手掌參樣品溶液按2.1項色譜條件進行分析,經(jīng)DAD檢測器驗證天麻素的峰純度后,按外標(biāo)法以峰面積計算,得青藏高原不同地區(qū)手掌參樣品中天麻素的量(n=3)。結(jié)果見表2。

    表1 天麻素回收率測定結(jié)果

    表2 青藏高原不同地區(qū)手掌參中天麻素的測定

    3 討論

    3.1 樣品提取方法的確定[10]

    考察冷浸、超聲和熱回流對手掌參中天麻素的量的影響,結(jié)果熱回流提取率最高。又分別以水、甲醇、乙醇為溶劑,考察不同溶劑對分析結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)甲醇對天麻素提取率最高。利用正交試驗進一步考察不同濃度甲醇、不同溶劑量、不同提取時間和提取次數(shù)對天麻素的量的影響,方差分析結(jié)果表明,天麻素提取率的影響因素依次為:甲醇濃度>提取時間>溶劑量>提取次數(shù)。考慮實際工作的方便、快捷,經(jīng)進一步試驗,確定最佳提取方法為甲醇濃度50%,溶劑量15 mL,提取時間2 h,提取次數(shù)2次。

    3.2 流動相的選擇

    天麻素色譜峰易拖尾,經(jīng)試驗,當(dāng)在水中加入0.01% ~0.10%磷酸時可改善天麻素峰形。最終選擇甲醇和含0.04%的磷酸水溶液(8∶92)為流動相。

    3.3 檢測波長的確定[11]

    利用DAD檢測器在200~400 nm掃描對照品溶液的吸收光譜,結(jié)果在222 nm處有最大吸收,因此選擇該波長為檢測波長。

    3.4 測定結(jié)果分析

    青藏高原不同地區(qū)藏藥手掌參中天麻素測定的結(jié)果顯示,手掌參中天麻素質(zhì)量分數(shù)在2.268~9.113 mg/g之間,含量有較大差異,其中以同德縣手掌參中天麻素中的量為最高。

    [1]楊永昌.藏藥志[M].西寧:青海人民出版社,1995:246.

    [2]中國科學(xué)院西北高原生物研究所.青海植物志:第4卷[M].西寧:青海人民出版社,1999:295-318.

    [3]青海省藥品檢驗所,青海省藏醫(yī)藥研究所.中國藏藥:一卷[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1996:341-344.

    [4]李 敏,王春蘭,郭順星,等.手參屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進展[J].中草藥,2006,37(8):1264-1268.

    [5]覃筱燕,云妙英,唐 麗,等.藏藥旺拉的化學(xué)成分及藥理活性的研究進展[J].中央民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,16(3):229-232.

    [6]Matsuda H,Morikawa T,Xie H H,et al.Antiallergic phenathrenes and stilbene from the tubers of Gymnaenia conopsea[J].Planta Med,2004,70(9):847-855.

    [7]訾佳辰.手參的化學(xué)成分研究[D].中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2008.

    [8]何 晶.天麻素的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].天津藥學(xué),2006,18(5):62-63.

    [9]楊蓓蓓,李 帥,張瑞萍,等.HPLC測定藏藥手掌參旺拉中4種有效成分的含量[J].中國中藥雜志,2009,34(14):1819-1822.

    [10]林鵬程,王永菊,祝存恩,等.青海不同地區(qū)藏藥麻花艽中環(huán)烯醚萜苷類成分的含量測定與品質(zhì)評價[J].中國藥學(xué)雜志,2006,41(10):783-785.

    [11]伍振峰,何 偉,馬建春.天麻中天麻素含量測定方法改進的研究[J].中成藥,2009,31(6):966-967.

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