野生與組培金線蓮有效成分的比較及RAPD分析

顧慧芬， 莊意麗， 梅其春

(1.上海市中藥研究所，上海 201401;2.復(fù)旦大學生命科學學院，上海 200433)

野生與組培金線蓮有效成分的比較及RAPD分析

顧慧芬1， 莊意麗1， 梅其春2

(1.上海市中藥研究所，上海 201401;2.復(fù)旦大學生命科學學院，上海 200433)

目的 研究人工栽培金線蓮替代金線蓮野生資源的可行性。方法 比較金線蓮組培苗與野生金線蓮藥材中多糖、氨基酸及總黃酮的量，采用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)對金線蓮組培苗及野生藥材進行了基因組DNA多態(tài)性分析。結(jié)果 多糖和總黃酮的比較表明，金線蓮組培苗與野生品(臺灣)的多糖和總酮量相近;總氨基酸比較表明，金線蓮組培苗中總氨基酸達9.17%，高于野生品的總氨基酸量;通過隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)，從中篩選出了能用于鑒別金線蓮組培苗的特異性引物。結(jié)論 初步證明通過組織培養(yǎng)獲得的金線蓮組培苗可以代替其野生品，它是解決金線蓮資源緊缺的有效途徑之一。

金線蓮;組培苗;多糖;氨基酸;總黃酮;RAPD

金線蓮是一種名貴珍稀中藥，具有清熱解毒、固腎平肝、降血糖等功效［1－2］，為蘭科 Orchidaceae 開唇蘭屬Anoectochilus植物花葉開唇蘭Anoectochilus roxburghii(Wall.)L.的全草。該植物主要分布在臺灣、福建、廣西、云南等地。由于其營養(yǎng)體繁殖緩慢，種胚發(fā)育不全，在自然狀態(tài)下難以繁殖，造成野生金線蓮的自然資源儲量日漸減少，已成為瀕危的藥用植物。近年來，國內(nèi)對名貴藥材的組織培養(yǎng)進行大量研究［3－4］，成功地利用組織培養(yǎng)技術(shù)對金線蓮進行無性快速繁育，解決了該植物資源匱乏的問題。然而，有關(guān)利用組織培養(yǎng)得到的金線蓮其有效成分等方面的研究則少見報道。

為了保護瀕危野生的金線蓮資源，開發(fā)組培金線蓮的藥用價值，本研究在應(yīng)用植物組培技術(shù)高效快速繁殖金線蓮基礎(chǔ)上，對組培金線蓮及野生金線蓮的主要活性成分如多糖、氨基酸和總黃酮進行了對比研究［5－9］，并進行了 RAPD 分析［10－12］，為金線蓮的產(chǎn)業(yè)化擴繁及工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料

野生金線蓮為多年生全草，由云南省屏邊縣科委提供。實驗用金線蓮組培苗高8～10 cm，由上海市中藥研究所于2002年7月進行無性快速繁殖培養(yǎng)。外植體為野生金線蓮(臺灣)，培養(yǎng)基為MS附加 NAA(α－萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、ZT(玉米素)，經(jīng)誘導(dǎo)形成的組培苗再進行無激素繼代培養(yǎng)，每月繼代一次。培養(yǎng)條件為:溫度(25±1)℃，光照強度:1 500 lx，每天光照12 h。所有實驗材料的憑證標本均存放在上海市中藥研究所。分光光度計為島津2401。

2 方法

2.1 金線蓮組培苗與野生藥材多糖測定

2.1.1 對照液制備 精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡聚糖標準品10.02 mg，至100 mL量瓶加蒸餾水至刻度，備用。

2.1.2 供試液制備 精密稱取剪碎后干燥的野生金線蓮(臺灣、云南、廣西)與金線蓮組培苗各2.0 g，置500 mL圓底燒瓶，加70%乙醇100 mL于沸水浴回流40 min，趁熱過濾，用80%乙醇沖洗濾液3次，每次10 mL，濾渣連濾紙置于燒瓶中加水60 mL提取2次，第1次1 h，第2次30 min，熱濾，用熱水沖洗3次，每次10 mL，濾液濃縮至10 mL，精吸1 mL，定容至200 mL，加活性炭脫色，過濾，濾液待用。

2.1.3 標準曲線的制作 準確稱取標準葡聚糖(或葡萄糖)10 mg于100 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度。分別吸取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，各以蒸餾水補至10 mL。吸取2.0 mL，加入5%苯酚1.0 mL及濃硫酸10 mL，搖勻冷卻，于485 nm測光密度，以2.0 mL水按同樣操作為空白，橫坐標為多糖毫克數(shù)，縱坐標為光密度值，繪制標準曲線。得線性方程:Y=8.225 8X+0.005 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。

2.1.4 多糖測定 取上述對照液和供試液各2.0 mL，分別置15 mL磨口試管中，各加5%苯酚溶液1 mL與硫酸10 mL，混勻，放置30 min。另取蒸餾水1 mL，同樣操作，作為空白。按分光光度法在485 nm波長處分別測定吸收度，測得多糖量。

2.2 金線蓮組培苗與原藥材氨基酸測定

取野生金線蓮(臺灣、廣西)與金線蓮組培苗各適量，對人體必需的18種氨基酸按國家標準GB/T5009.124－2003方法進行測定。

2.3 金線蓮組培苗與野生藥材總黃酮測定

2.3.1 對照液制備 精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標準品21.87 mg于100 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度備用。

2.3.2 供試液制備 精密稱取干燥的野生金線蓮(臺灣、云南、廣西)與金線蓮組培苗粉末各1 g，置50 mL三角燒瓶，加70%乙醇25 mL，稱定重量，超聲波提取30 min，冷卻至室溫，以70%乙醇補足損失的量，過濾，取續(xù)濾液1 mL，定容至10 mL量瓶，備用。

2.3.3 標準曲線的制作 準確稱取標準品蘆丁21.87 mg于100 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，再稀釋 1 倍，分別吸取 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，各以70%乙醇補至10 mL，吸取5.0 mL分別加入0.1 mol/L三氯化鋁3 mL和1 mol/L醋酸鉀5 mL，混勻，顯色40 min，于420 nm波長處分別測定吸收度，以5.0 mL水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為蘆丁的量(mg)，縱坐標為光密度值，繪制標準曲線。得線性方程:Y=12.645X+0.021 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 963。

2.3.4 總黃酮測定 取上述對照液和供試液各5.0 mL，分別置15 mL磨口試管中，各加0.1 mol/L三氯化鋁3 mL和1 mol/L醋酸鉀5 mL，混勻，顯色40 min。另取蒸餾水5.0 mL，同樣操作，作為空白。按分光光度法在420 nm波長處分別測定吸收度，測得總黃酮量。

2.4 金線蓮組培苗與野生藥材RAPD分析

2.4.1 DNA的提取 分別取野生金線蓮(臺灣、云南、廣西)與金線蓮組培苗莖葉0.5 g于研缽中，剪碎后倒入液氮研成細粉，加入600 μL預(yù)熱至60℃的 CTAB 抽提緩沖液(100 mmol/L pH8.0 Tris－HCl，5 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2%2－巰基乙醇，2%PVP)，60℃水浴作用60 min并不時振蕩混合。取出后加入2/3體積的三氯甲烷－異戊醇(24∶1)，輕柔顛倒5 min，放入4℃冰箱靜置10～30 min;14 000 r/min離心10 min，定量吸取上清液，加入2/3體積的－20℃異丙醇，緩緩混勻數(shù)次，放入－20℃冰箱沉淀30 min至過夜;取出，15 000 r/min離心10 min，傾去上清液，以洗滌緩沖液洗滌沉淀2次。再用75%乙醇洗滌2次，揮干乙醇;加入400 μL TE溶解沉淀，加入1/10體積的NaAc，再加入2體積－20℃無水乙醇重沉淀1 h至過夜;取出15 000 r離心10 min，傾去上清，用75%乙醇洗滌2次，30℃烘箱烘干乙醇，加入100 μL TE溶解。提取后的DNA樣品各取8 μL上樣于1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。取部分為實驗用，其余置于－20℃保存。

2.4.2 引物篩選 實驗篩選了35個隨機引物，其中14個引物擴增顯示有多態(tài)性條帶，且具有良好的種間特異性;實驗最終選擇擴增多態(tài)性好，并具有種內(nèi)特異性的引物，對野生金線蓮(臺灣、廣西、云南)與金線蓮組培苗進行分析。

2.4.3 PCR的擴增和電泳檢測 PCR擴增:擴增總體積 25 μL，其中無菌水15.78 μL，10 × PCR buff－

er 2.5 μL，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+2 mmol/L，引物0.3 μmol/L，Taq 酶 0.5 U，DNA 模板 4 μL(抽提原液稀釋 10倍)。在 ThermojeT PCR儀(比利時EquiBio)上進行擴增。擴增程序如下:90℃變性3 min，36℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min;90℃ 1 min，36℃ 1 min，72℃延伸2 min，40個循環(huán);最后72℃延伸7 min。取擴增產(chǎn)物8 μL在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，由北京亞力恩機電技術(shù)研究所生產(chǎn)的YLN 2000凝膠影像分析系統(tǒng)照相。所有的反應(yīng)均進行兩次或兩次以上，且只有具有重復(fù)性(重復(fù)兩次或以上)的多態(tài)性條帶被用作實驗結(jié)果并進行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 金線蓮組培苗與野生藥材多糖比較 通過對野生金線蓮(臺灣、云南、廣西)與金線蓮組培苗有效成分多糖進行比較，發(fā)現(xiàn)組培苗植株多糖量與野生植株(臺灣)多糖量接近，分別為 18.68%、19.18%，野生品(廣西)較低，僅6.70%，見表1。

表1 不同來源金線蓮總多糖量比較Tab.1 Comparative analysis of total polysaccharides in Anoectochilus roxburghii from different sources

3.2 金線蓮組培苗與野生藥材氨基酸比較 野生金線蓮(臺灣、廣西)與金線蓮組培苗的氨基酸測試結(jié)果見表2。比較顯示，從組成成分來看，金線蓮組培苗與其他不同來源金線蓮野生藥材中18種氨基酸及它們的量相近，其中以門冬氨基酸量最高，金線蓮組培苗，臺灣金線蓮，廣西金線蓮的總氨基酸質(zhì)量分數(shù)分別為9.17%、6.25%、6.30%。

表2 不同來源金線蓮氨基酸比較Tab.2 Comparative analysis of amino acids in Anoectochilus roxburghii from different sources

3.3 金線蓮組培苗與野生藥材黃酮比較 通過對金線蓮組培苗與野生金線蓮(臺灣、云南、廣西)有效成分總黃酮進行比較，發(fā)現(xiàn)組培苗植株總黃酮量與野生植株總黃酮量接近，見表3。

表3 不同來源金線蓮總黃酮比較Tab.3 Comparative analysis of total flavonoid in Anoectochilus roxburghii from different sources

3.4 金線蓮組培苗與原藥材RAPD分析 采用CTAB法，提取了組培金線蓮與野生金線蓮的總基因組，從35個10－Mer隨機引物中，篩選出8個有效引物，共檢出85個不同的多態(tài)性條帶，獲得了清晰穩(wěn)定重現(xiàn)性好的基因組DNA多態(tài)性指紋圖譜，每個引物產(chǎn)生的標記數(shù)在5～19之間，具有良好的種內(nèi)特異性。

3.5 DNA多態(tài)性分析 對35個隨機引物進行篩選，選擇出8個擴增效果、重復(fù)性均較好的引物進行拍照.從擴增的結(jié)果來看，不同的產(chǎn)地之間存在著明顯的多態(tài)性，初步證明運用RAPD方法可以區(qū)分不同產(chǎn)地的金線蓮。以引物 S－120(5′－GGGAGACATC－3′)的擴增結(jié)果為例，其擴增結(jié)果如圖1所示。圖1上顯示金線蓮組培苗的擴增多態(tài)性條帶與野生金線蓮(臺灣)基本一致，由此可判斷組培金線蓮來源于野生金線蓮(臺灣)，應(yīng)為同一物種。

圖1 用引物S-120擴增得到的RAPD圖譜Fig.1 The RAPD patterns amplified by primer S-120

4 討論

金線蓮組培苗所含的總多糖、18種氨基酸的量(門冬氨酸例外)及總黃酮與野生金線蓮(臺灣)相近，這表明，在金線蓮的野生種源儲量日漸減少，已成為瀕危的藥用植物的情況下，采取組織培養(yǎng)方式解決中藥金線蓮藥源問題是可行的。

RAPD分析顯示金線蓮組培苗的擴增多態(tài)性條帶與野生金線蓮(臺灣)基本一致，說明采用RAPD方法可以鑒定出金線蓮組培苗的來源。研究結(jié)果為藥用植物組培苗的可持續(xù)開發(fā)和利用提供了科學的保證。同時，這一技術(shù)路線和方法的建立，為我國珍貴、稀有、瀕危的地道藥材的鑒定提供了一種新思路。

研究結(jié)果還表明，通過組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的金線蓮，也具有較高的藥用價值，不像人們認為的野生金線蓮的有效成分遠遠優(yōu)于人工培養(yǎng)金線蓮的觀點，甚至人工培養(yǎng)的金線蓮在某些有效成分方面還具有一定的優(yōu)越性。在目前金線蓮藥源緊缺的情況下，采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行人工培養(yǎng)金線蓮具有較好的應(yīng)用前景。

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Comparison of effective components and RAPD between wild and tissue culture seedlings ofAnoectochilus roxburghii

GU Hui-fen1， ZHUANG Yi-1i1， MEI Qi-chun2
(1.Shanghai Institute of Chinese Materia Medica，Shanghai 201401，China;2.School of Life Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200433，China)

AIMTo call for the feasibility study into the scheme for replacing wildAnoectochilus roxburghiiby the tissue culture seedlings.METHODSThe contents of ploysaccharides，amino acid and total flavonoids between wild and tissue culture seedlings ofAnoectochilus roxburghiiwere compared，and the random amplified polymorphic DNA(RAPD)was used to analyze both genetic relationship.RESULTSThe contents of ploysaccharides and total flavonoids in the tissue culture seedlings were similar to the wild species from Taiwan district，but the content of total flavonoids of the tissue culture seedlings reached 9.17%，was higher than that in the wild species.A specific primer selected to identify the original species of the tissue culture seedlings was found in the RAPD analyses.CONCLUSIONThe study preliminarily proved that replacing wildAnoectochilus roxburghiiby the tissue culture seedlings is feasible and it is possible to solve the shortage of wild resources in this species.

Anoectochilus roxburghii;tissue culture seedlings;polysaccharides;amino acid;total flavonoids;RAPD

R284.1

A

1001-1528(2011)08-1364-04

2010-01-25

上海市科委項目(02DZ19171)

顧慧芬(1960—)，女，高級工程師，從事植物藥資源及植物藥分子研究。Tel:(021)37565589，E-mail:ghuif@126.com