蛋白質(zhì)組學(xué)在骨疾病及成骨細(xì)胞分化中的應(yīng)用*

李 穎 劉洪臣

1.蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及其研究方法

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念 蛋白質(zhì)組概念最早于1994年由澳大利亞的科學(xué)家Wilkins等[1]提出，蛋白質(zhì)組學(xué)主要是系統(tǒng)性研究一種基因組、一種生物或者一種細(xì)胞(組織)所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念,在同一個(gè)機(jī)體的不同組織和細(xì)胞中不相同,在同一機(jī)體的不同發(fā)育階段,不同的生理狀態(tài)下,乃至不同的外界環(huán)境下也不相同。各種復(fù)雜的生命活動(dòng),都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時(shí)間和空間不同組合的結(jié)果。如今，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)發(fā)展了近20年，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于分析翻譯后水平的蛋白表達(dá)。在細(xì)胞生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，細(xì)胞的蛋白質(zhì)組和基因組是不斷改變的。蛋白多樣性的大幅度上升可能主要?dú)w因于選擇性剪接[2,3]和蛋白的翻譯后修飾[4,5]。蛋白多樣性不能完全地被單純基因表達(dá)分析所描述，蛋白質(zhì)組學(xué)為發(fā)現(xiàn)感興趣的細(xì)胞和組織的生物標(biāo)記提供了一種有前景的工具。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)

1.2.1 雙向凝膠電泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE) 2-DE是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同將蛋白質(zhì)彼此分離,然后再根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量不同將其在垂直方向進(jìn)一步分離。這樣蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間能彼此較好地分離,然后采用計(jì)算機(jī)作基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理,對(duì)電泳圖譜進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)、背景消減和數(shù)據(jù)構(gòu)建等分析。

1.2.2 質(zhì)譜分析(Mass Spectrographic analysis,MS) 質(zhì)譜技術(shù)是將樣品分子離子化后根據(jù)離子間的質(zhì)核比和基質(zhì)的差異來(lái)分析并確定分子量的方法。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定2-DE分離的蛋白質(zhì)。近年來(lái)新發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解吸離子電離(MALDI)和電噴霧電離(Electrospray，ES)使質(zhì)譜不僅能分析小分子物質(zhì)，也可研究生物大分子,如蛋白質(zhì)和肽等[6,7]。每種蛋白基于堿基序列都會(huì)有一個(gè)特異的肽質(zhì)量指紋(PMF)，這樣，通過(guò)質(zhì)譜儀檢測(cè)出的肽質(zhì)量就可以從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出特異的蛋白[8]。

1.2.3 質(zhì)譜成像(Imaging Mass Spectrometry)技術(shù) 質(zhì)譜成像直接利用M S對(duì)組織切片蛋白鑒定是近年來(lái)出現(xiàn)的新方法[9]。MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)不局限于特異的一種或者幾種蛋白質(zhì)分子，它可在正常及病變的組織切片中找到每一種蛋白質(zhì)分子，并提供這些蛋白質(zhì)分子在組織中的空間分布的精確信息，而事先無(wú)需知道所檢測(cè)蛋白的信息，同時(shí)可對(duì)這些蛋白質(zhì)分子含量進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。Schwartz等[10]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床研究中成功應(yīng)用MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)直接病變和正常組織中蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，該方法有很高的敏感度和特異度，而且可用于預(yù)后判斷。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)中的新技術(shù)

1.3.1 DIGE技術(shù)(Differencegelelectrophoresis，D1GE) 差異凝膠電泳，是在雙向凝膠電泳的基礎(chǔ)上又形成了一項(xiàng)新技術(shù)，即將樣品在雙向電泳之前分別用不同熒光(如Cy2，Cy3，Cy5)標(biāo)記，然后將標(biāo)記后的3種樣品混合，同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行電泳，所得到的2D膠圖像可使用3種不同的激發(fā)／發(fā)射過(guò)濾器得到不同顏色熒光信號(hào)，根據(jù)這些信號(hào)的比例來(lái)判斷樣品之間蛋白質(zhì)的差異。在2D-DIGE技術(shù)中，每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，軟件會(huì)根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測(cè)到的蛋白豐度變化都真實(shí)。

1.3.2 iTRAQ技術(shù)(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ) 相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記技術(shù)，是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在2004年推出的一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)。iTRAQ技術(shù)使用8種不同的同位素試劑來(lái)同時(shí)標(biāo)記和比較8種不同的蛋白質(zhì)樣品。這些試劑由3個(gè)不同的化學(xué)標(biāo)簽組成，標(biāo)簽分子分別由報(bào)道基團(tuán)(reporter group)、平衡基團(tuán)(balance group)和反應(yīng)基團(tuán)(reactive group)組成。使用該技術(shù)不僅可尋找差異表達(dá)蛋白，并分析其蛋白功能，同時(shí)可以對(duì)1個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或1個(gè)復(fù)雜的混合體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定。該技術(shù)具有較好的定量效果、較高的重復(fù)性。由于其能夠同時(shí)對(duì)多達(dá)8種樣品進(jìn)行標(biāo)記分析，故在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

1.3.3 ICAT(Isotope-coded affinity tag) 同位素代碼標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用一種含與蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)、乙烯甘油結(jié)合區(qū)和生物素標(biāo)記的試劑，可專(zhuān)與蛋白質(zhì)或肽段的L2半胱氨酸的巰基反應(yīng),所帶的同位素標(biāo)記為含8個(gè)氫原子的(d0)輕試劑和8個(gè)氘原子的(d8)重試劑，將一個(gè)蛋白質(zhì)樣品用輕試劑標(biāo)記,另一個(gè)樣品用重試劑標(biāo)記,然后將兩個(gè)樣品混合,經(jīng)胰蛋白酶或Lys-C水解蛋白得到肽片段。混合的樣品用抗生物素蛋白親和層析法分離。這些肽段進(jìn)行進(jìn)一步質(zhì)譜分析。它的好處在于可以將混合樣品(來(lái)自正常和病變細(xì)胞或組織等)直接測(cè)試；還可快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質(zhì)、尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等。

2.蛋白質(zhì)組學(xué)在骨疾病中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)也已經(jīng)應(yīng)用于骨疾病的研究，尋找骨生物標(biāo)記和細(xì)胞信號(hào)[11]。在骨疾病的領(lǐng)域，傳統(tǒng)的2-DE和質(zhì)譜分析是一種標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)比較正常和疾病間蛋白表達(dá)情況，通過(guò)這種方法已經(jīng)獲得軟骨降解、骨腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎和股骨頭壞死與正常組織間的特異的蛋白表達(dá)譜[12-19]。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究，表1總結(jié)了應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)骨疾病中發(fā)現(xiàn)的蛋白標(biāo)記。這些研究的主要目的就是為了發(fā)現(xiàn)疾病的特異性蛋白標(biāo)記，利于機(jī)制研究。然而，這種分析會(huì)產(chǎn)出大量的生物學(xué)信息很難去辨別。蛋白質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用于活體實(shí)驗(yàn)試圖揭示細(xì)胞性活動(dòng)和細(xì)胞培養(yǎng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]，但這樣的發(fā)現(xiàn)對(duì)于體外是否具有同樣的意義還是未知的。

3.蛋白質(zhì)組學(xué)在成骨細(xì)胞分化中的應(yīng)用

自從認(rèn)識(shí)到，由于骨形成障礙以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的不平衡會(huì)導(dǎo)致骨疾病[21]，最近的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在這些細(xì)胞的分化和它們的功能研究上。成骨細(xì)胞來(lái)源于多向分化潛能的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)，可以合成骨基質(zhì)，而破骨細(xì)胞來(lái)源于單核細(xì)胞，可以吸收骨[22]。成骨細(xì)胞在很多代謝性疾病中都受到一定的影響，吳璇等[23]研究證實(shí)糖尿病大鼠頜骨成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)以及成骨相關(guān)基因Runx2表達(dá)異常。到目前為止，有許多研究對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的自我更新和分化，以及成骨性方面進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。骨髓基質(zhì)細(xì)胞，也指可塑粘附細(xì)胞和集落形成成纖維細(xì)胞，具有多向分化潛能和自我更新能力[24,25]。新的分子和細(xì)胞技術(shù)用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的定量和生物標(biāo)記，包括 STRO-1、CD29、CD44、 CD90、CD105、CD166 和 MHC-1[26]。然而，這些生物標(biāo)記并不特異性得表達(dá)在干細(xì)胞上，控制骨髓基質(zhì)細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制也尚不清楚。通過(guò)雙向電泳進(jìn)行蛋白分離，而后進(jìn)行質(zhì)譜分析獲得在分化階段骨髓基質(zhì)干細(xì)胞克隆的蛋白質(zhì)組信息。這些信息的研究表明，低擴(kuò)增分化傳代培養(yǎng)BMSC，其差異蛋白主要分以下幾種功能類(lèi)：代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞間作用、細(xì)胞周期、蛋白降解和鐵代謝。尤其，高擴(kuò)增(少分化)與低擴(kuò)增的BMSC相比，鈣調(diào)蛋白、T-complex protein 1 α-亞基和原肌球蛋白上調(diào)，而鈣調(diào)合素蛋白和minralocorticoid receptor下調(diào)[27，29]。認(rèn)為這些蛋白與細(xì)胞周期和增殖有關(guān)[28]，對(duì)于骨代謝是也有一定作用[30]。另外一些研究，利用雙向電泳和質(zhì)譜分析研究MSC向成骨細(xì)胞分化，得出了標(biāo)準(zhǔn)的成骨細(xì)胞分化的蛋白信息。一些特異性的差異蛋白，比如chloride intracellular channel 1，認(rèn)為它對(duì)成骨細(xì)胞分化起到了重要的作用[31,32]。

表1 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)在骨疾病中發(fā)現(xiàn)的蛋白標(biāo)記。

Spreafico做的2D-PAGE的研究，主要比較了初期培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞在不同分化階段分離，從前成骨細(xì)胞(E1細(xì)胞)到分化了的成骨細(xì)胞(E1P1細(xì)胞)蛋白質(zhì)組的差異[33]。結(jié)果顯示，顯現(xiàn)出2400個(gè)差異點(diǎn)，這些點(diǎn)中，有3個(gè)僅在E1膠中有，32個(gè)點(diǎn)只在E1P1膠中發(fā)現(xiàn)。在E1P1細(xì)胞蛋白質(zhì)組中總共17個(gè)蛋白上調(diào)。大多數(shù)上調(diào)的蛋白并沒(méi)有被報(bào)道認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)者。這些蛋白可以唄分為4個(gè)功能組：細(xì)胞結(jié)構(gòu)活力，蛋白降解，能量產(chǎn)生和抗氧化保護(hù)。在E1P1細(xì)胞中觀察到Cathepsin D顯著上調(diào)，這可能與他在TGF-β以及胰島素樣生長(zhǎng)因子-II(IGF)的細(xì)胞外加工作用有關(guān)系，這兩個(gè)蛋白被認(rèn)為是促進(jìn)成骨有絲分裂的重要因子。E1P1細(xì)胞中另外上調(diào)的的蛋白是UCH-L1，硫氨基水解酶(thiol-hydrolase)，屬于泛肽依賴(lài)蛋白水解系統(tǒng)，對(duì)于真核生物正常生長(zhǎng)以及分化很重要。這項(xiàng)研究是第一個(gè)報(bào)道UCH-L1在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中上調(diào)的。然而，這個(gè)在之前已有研究認(rèn)為它參與了神經(jīng)元細(xì)胞的分化。之前還有報(bào)道過(guò)其他一些酶是成骨細(xì)胞分化的重要因子，比如α-enolase，ATP合成酶，谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶，在E1P1細(xì)胞中同樣上調(diào)。另外，Spreafico深入研究比較了SaOS-2細(xì)胞系和E1P1成骨細(xì)胞，試圖鑒定與骨肉瘤腫瘤發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)的標(biāo)記，這些有可能應(yīng)用與腫瘤診斷和轉(zhuǎn)移可能性的評(píng)估。另外，一種堿性磷酸酶的過(guò)表達(dá)，肌酸激酶亞型B，150kDa的氧調(diào)控蛋白，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白4認(rèn)為潛在腫瘤標(biāo)記物。關(guān)于分化的成骨細(xì)胞，SaOS-2和E1前成骨細(xì)胞的Hsp27、Cathepin D、過(guò)氧化物歧化酶、谷胱苷肽脫氫酶、降鈣素和烯酰輔酶A水解樣蛋白都表現(xiàn)出明顯下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)顯示他們可作為成骨細(xì)胞分化標(biāo)志的潛能。

最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，一些激素，生長(zhǎng)因子和酶可以調(diào)控成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，成熟和活性[33]，提示這些循環(huán)因素可能通過(guò)特定的信號(hào)通路來(lái)影響成骨分化。MSC給予特定的激素或生長(zhǎng)因子后，對(duì)其蛋白提取物進(jìn)行雙向電泳和質(zhì)譜分析，為了獲得可能在特定信號(hào)通路起重要作用的差異蛋白[34-36]。用加入EGF和PDGF培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，該培養(yǎng)基中還包含了特殊形式的精氨酸，比如常規(guī)的12C6,14N4，或是同位素變異的12C6,14N4或是13C6,15N4，代謝性標(biāo)記了整個(gè)蛋白組，用同位素標(biāo)記定量的質(zhì)譜分析軟件，使這些標(biāo)記了的蛋白在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)可以被區(qū)分出來(lái)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以直接比較整個(gè)受EGF和PDGF調(diào)控的成骨分化的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，也能發(fā)現(xiàn)兩因素在PI3K通路中的重要的差異[37]。

Olkku研究發(fā)現(xiàn)地塞米松對(duì)人成骨細(xì)胞系(比如 MG-63,G-292,SaOD-2和 U2-OS)、一定條件下永生的人前成骨細(xì)胞(HOB-03-C5)以及人成熟成骨細(xì)胞(HOB-03-CE6)蛋白表達(dá)的影響[38]。研究表面在給予地塞米松治療后，主要上調(diào)了MG-63、G-292、HOB-03-C5和HOB-03-CE6細(xì)胞中的谷氨酰胺合成酶，最先在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平觀察到地塞米松誘導(dǎo)該酶的上調(diào)。當(dāng)時(shí)關(guān)于谷氨酰胺合成酶在骨細(xì)胞中的作用還很鮮為人知的時(shí)候，Olkku認(rèn)為在誘導(dǎo)谷氨酰胺合成酶和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的凋亡間沒(méi)有直接的聯(lián)系。

Salasznyk用蛋白質(zhì)組學(xué)比較了人成骨細(xì)胞和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞之間的蛋白表達(dá)差異[39]，這個(gè)研究集中于鑒定潛在的成骨標(biāo)記，結(jié)果顯示有737個(gè)不同的蛋白點(diǎn)?？偣灿?57個(gè)(34%)的點(diǎn)在兩種細(xì)胞中都表達(dá)，剩下的480個(gè)點(diǎn)中有312(65%)證明僅在成骨細(xì)胞中表達(dá)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明在成熟的成骨細(xì)胞和那些未分化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組有著顯著差異。

有研究為了鑒定伴侶蛋白表達(dá)形式，比較了包括成骨細(xì)胞起源的骨肉瘤細(xì)胞(SaOS-2)在內(nèi)的10種腫瘤細(xì)胞系[40]。在凝膠內(nèi)消化后應(yīng)用MALDI-MS鑒定蛋白，得到鑒定伴侶蛋白的列表，這些伴侶蛋白在不同細(xì)胞系中有不同的表達(dá)形式。有意思的是，有一個(gè)和腫瘤排斥抗原相似的蛋白僅在SaOS-2細(xì)胞中表達(dá)，而應(yīng)力誘導(dǎo)的磷蛋白1在所有腫瘤細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)，唯獨(dú)除了SaOS-2細(xì)胞。脂皮質(zhì)蛋白I，一種細(xì)胞分化和凋亡的啟動(dòng)子，其在SaOS-2中表達(dá)的下降與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性是相一致的。脂皮質(zhì)蛋白II在很多腫瘤細(xì)胞中上調(diào),它的低表達(dá)可能是骨肉瘤細(xì)胞外基質(zhì)顯著性減少的特性表現(xiàn)。該研究表明，用人的原始細(xì)胞取代永生化的細(xì)胞系，提供了一個(gè)很好的機(jī)會(huì)將獲得的成骨推向臨床調(diào)查。

4.展望

綜上所述,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在骨相關(guān)疾病以及成骨分化中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，研究技術(shù)不斷進(jìn)步并取得了一些成績(jī)，但是該技術(shù)在這一領(lǐng)域的應(yīng)用目前還處于比較膚淺的階段，主要用于蛋白質(zhì)組表達(dá)模式分析，真正涉及功能蛋白質(zhì)組的研究還很少，與實(shí)際應(yīng)用的差距則更遠(yuǎn)。我們相信，隨著方法的不斷改進(jìn)與研究的不斷深入，蛋白質(zhì)組學(xué)在骨相關(guān)疾病研究領(lǐng)域?qū)⒂惺謴V闊的應(yīng)用前景，為骨相關(guān)疾病的臨床診斷及診治提供更可靠有效的幫助。

[1]Wilkins MR,Sanchez JC,Gooley AA,et al.Progress with proteome projects：why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it[J].Biotechnol Genet Eng Rev,1996,13(6)：19250

[2]OyamaM,Kozuka-HataH,SuzukiY,SembaK,Yamamoto T,Sugano S.Diversity of translation start sites may define increased complexity ofthe human short ORFeome[J].Mol Cell Proteomics,2007,6：1000-1006

[3]Jimenez CR,Spijker S,de Schipper S,et al.Peptidomics of a single identified neuron reveals diversity of multiple neuropeptides with convergent actions on cellular excitability[J].J Neurosci,2006,26：518-529

[4]Helmerhorst EJ,Oppenheim FG.Saliva：a dynamicproteome[J].J Dent Res,2007,86：680-693

[5]Kiernan UA.Quantification of target proteins and post-translational modifications in affinity-based proteomic approaches[J].Expert Rev Proteomics,2007,4(3)：421-428

[6]Yan JX,SanchezJC,BinzPA,etal.Method for identification and quantitative analysis of protein lysine methylation using matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometry and amino acid analysis[J].Electrophoresis,1999,20(4～5)：749-754

[7]Whitelegge JP,le Coutre J,Lee JC,et al.Toward the bilayer proteome,electrospray ionization2mass spectrometry of large,intact transmembrane proteins[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(19)：10695-10698

[8]Gygi SP,Rist B,Gerber SA,et al.Quantitative analysis of complexproteinmixturesusingisotope-codedaffinitytags[J].Nat Biotechnol,1999,17：994-999

[9]Caprioli RM.Deciphering protein molecular signatures in cancer tissues to aid in diagnosis,prognosis,and therapy[J].Cancer Res,2005,65：10642-10645

[10]Schwartz SA,Weil RJ,Thompson RC,etal.Prote omic-based prognosis of brain tumor patients using direct-tissue matrix-assisted laserdesorption ionization mass spectrometry[J].Cancer Res,2005,65：7674-7681

[11]Kubota K,Wakabayashi K,Matsuoka T.Proteome analysis of secreted proteins during osteoclast differentiation using two different methods：two-dimensional electrophoresis and isotope-coded affinity tags analysis with two-dimensional chromatography[J].Proteomics,2003,3：616-626

[12]Zhao Y,Lee WN,Xiao GG.Quantitative proteomics and biomarkerdiscovery in human cancer[J].ExpertRev Proteomics,2009,6(2)：115-118

[13]Wilson R,Belluoccio D,Little CB,Fosang AJ,Bateman JF.Proteomic characterization of mouse cartilage degradation in vitro[J].Arthritis Rheum,2008,58：3120-3131

[14]Kawai A,Kondo T,Suehara Y,Kikuta K,Hirohashi S.Global protein-expression analysis of bone and soft tissue sarcomas[J].Clin Orthop Relat Res,2008,466：2099-2106

[15]Guo D,Tan W,Wang F,et al.Proteomic analysis of human articular cartilage：identification of differentially expressed proteins in knee osteoarthritis[J].Joint Bone Spine,2008,75：439-444

[16]Tan X,Cai D,Wu Y,et al.Comparative analysis of serum proteomes： discovery of proteins associated with osteonecrosis of the femoral head[J].Transl Res,2006,148：114-119

[17]Folio C,Mora MI,Zalacain M,et al.Proteomic analysis of chemonaive pediatric osteosarcomas and corresponding normal bone reveals multiple altered molecular targets[J].J Proteome Res,2009,8(8)：3882-3888

[18]Kang JH,Park KK,Lee IS,et al.Proteome analysis of responses to ascochlorin in a humanosteosarcoma cell line by 2-D gel electrophoresis and MALDI-TOF MS[J].J Proteome Res,2006,5：2620-2631

[19]Xiao GG,Recker RR,Deng HW.Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery[J].Clin Med Oncol,2008,2：1-10

[20]Cubukcuoglu Deniz G,Durdu S,Akar AR,Ozyurda U.Biotechnology and stem cell research：a glance into the future[J].Anadolu Kardiyol Derg,2008,8：297-302

[21]Rodan GA.Bone mass homeostasis and bisphosphonate action[J].Bone,1997,20：1-4

[22]Teitelbaum SL.Bone resorption by osteoclasts[J].Science,2000,289：1504-1508

[23]吳 璇，劉洪臣，馬衛(wèi)東，等.糖尿病大鼠下頜骨成骨細(xì)胞體外特性的研究[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2008,6(2)：97-100

[24]Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature,2002,418：41-49

[25]Hassan HT,El-Sheemy M.Adult bone-marrow stem cells and their potential in medicine[J].J R Soc Med,2004,97：465-471

[26]Kolf CM,Cho E,Tuan RS.Biology of adult mesenchymal stem cells：regulation of niche, self-renewal and differentiation[J].Arthritis Res Ther,2007,9：204

[27]Celebi B,Elcin YM.Proteome analysis of rat bone marrow mesenchymal stem cell subcultures[J].J Proteome Res,2009,8：2164-2172

[28]Mareddy S,Broadbent J,Crawford R,Xiao Y.Proteomic profiling of distinct clonal populations of bone marrow mesenchymal stem cells[J].J Cell Biochem,2009,106：776-786

[29]Foster LJ,Zeemann PA,Li C,Mann M,Jensen ON,Kassem M.Differential expression profiling of membrane proteins by quantitative proteomics in a human mesenchymal stem cell line undergoing osteoblast differentiation[J].Stem Cells,2005,23：1367-1377

[30]Zhang L,Feng X,McDonald JM.The role of calmodulin in the regulation of osteoclastogenesis[J].Endocrinology,2003,144：4536-4543

[31]Sun HJ,Bahk YY,Choi YR,et al.A proteomic analysis during serial subculture and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cell[J].J Orthop Res,2006,24：2059-2071

[32]Spreafico A,Frediani B,Capperucci C,et al.A proteomic study on human osteoblastic cells proliferation and differentiation[J].Proteomics,2006,6：3520-3532

[33]Siris,ES,Roodman,GD.Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism[J].ASBMR,2006,320-330

[34]Kim SH,Jun S,Jang HS,Lim SK.Identification of parathyroid hormone-regulated proteins in mouse bone marrow cells by proteomics[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,330：423-429

[35]Xu J,Khor KA,Sui J,Zhang J,Tan TL,Chen WN.Comparative proteomics profile of osteoblasts cultured on dissimilar hydroxyapatite biomaterials：an iTRAQ-coupled 2-D LC-MS/MS analysis[J].Proteomic,2008,8：4249-4258

[36]Bennett KP,Bergeron C,Acar E,et al.Proteomics reveals multiple routes to the osteogenic phenotype in mesenchymal stem cells[J].BMC Genomics,2007,8：380

[37]Kratchmarova I,Blagoev B,Haack-Sorensen M,Kassem M,Mann M.Mechanism of divergent growth factor effects in mesenchymal stem cell differentiation[J].Science,2005,308：1472-1477

[38]Olkku A,Bodine PV,Linnala-Kankkunen A,Mahonen A.Glucocorticoids induce glutamine synthetase expression in human osteoblastic cells：a novel observation in bone[J].Bone,2004,34,320-329

[39]Salasznyk RM,Westcott AM,Klees RF,et al.Comparing the protein expression profiles of human osteoblasts using gene ontologies[J].Stem Cell Dev,2005,14：354-366.

[40]Myung JK,Afjehi-Sadar L,Lubec G.Expressional patterns of chaperones in ten human tumor cell line[J].Proteomics Sci,2004,2：8