異甘草素固體脂質(zhì)納米粒包封率測(cè)定方法的研究

陳衛(wèi)軍，袁勇，王魯妹，智永剛（.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，石河子市 832008；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子市 832002）

異甘草素（Isoliquiritigenin，ISO）是甘草黃酮中的一種查爾酮成分，對(duì)結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、大腸癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用[1～3]。但I(xiàn)SO水溶性差，影響了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，尋找合適的藥物劑型成為改善異甘草素的水溶性的有效途徑。

固體脂質(zhì)納米粒（SLN）是極具開發(fā)潛力的藥物載體，作為水溶性差的藥物載體具有許多優(yōu)越性，其應(yīng)用日益受到重視[4，5]。本研究采用高壓乳勻法制備ISO-SLN，建立其包封率的測(cè)定方法，結(jié)果表明，該法操作簡(jiǎn)單、可行、準(zhǔn)確性較好，為ISO-SLN的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2201紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；FSH-Ⅱ高速電動(dòng)勻漿器（江蘇金壇市正基儀器有限公司）；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所）；NS1001L PANDA 2K型高壓勻質(zhì)機(jī)（意大利Niro Soavi公司）；THZ-C振蕩儀（江蘇太蒼市實(shí)驗(yàn)儀器廠）；透析袋（進(jìn)口分裝，相對(duì)分子質(zhì)量：12000～14000，批號(hào)：20050102）。

1.2 試藥

ISO（西安旭煌生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：080631，含量：＞98%）；大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)：070614，含量：90%）；泊洛沙姆188（南京威爾化工有限公司）；ISO-SLN（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，批號(hào)：090702，規(guī)格：0.1 mg·mL－1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 ISO-SLN的制備

采用高剪切乳化-高壓乳勻法制備ISO-SLN。取處方量的ISO、單硬脂酸甘油酯和大豆卵磷脂，在（80±5）℃水浴下，使其完全溶解于10 mL無(wú)水乙醇中，作為有機(jī)相；取適量的泊洛沙姆188分散于同溫度的50 mL水中，作為水相。在1800 r·min－1攪拌條件下，將有機(jī)相緩慢注入（80±5）℃水相中，持續(xù)攪拌2 h，形成初乳，在室溫下，150 MPa高壓乳勻5次，迅速冷至室溫，得ISO-SLN水分散液。同法制備不含ISO的空白納米粒分散液。

2.2 紫外分光光度法測(cè)定ISO-SLN中藥物含量

2.2.1 ISO最大吸收波長(zhǎng)的選擇。精密移取ISO-SLN水分散液0.5 mL，無(wú)水乙醇10 mL超聲10 min進(jìn)行消解，空白納米粒分散液同法處理后，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，掃描紫外吸收光譜。結(jié)果，ISO在396 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，空白納米粒分散液無(wú)干擾，見圖1。

2.2.2 ISO-SLN中藥物濃度的測(cè)定。精密吸取ISO-SLN分散液0.5 mL置于10 mL容量瓶中，加適量無(wú)水乙醇超聲10 min進(jìn)行消解，定容，在396 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A，計(jì)算ISO質(zhì)量濃度c。

2.2.3 ISO標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。取ISO約10.0 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，制得濃度為1.12 mg·mL－1的貯備液。精密移取貯備液適量，置于100 mL的容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，制得濃度為11.2 μg·mL－1ISO稀釋液。分別精密移取ISO稀釋液適量，置于10 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，制得濃度為1.12、2.24、3.36、4.48、5.6、6.72、7.84 μg·mL－1的ISO溶液。以A對(duì)c進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 A＝0.10899c－0.0044（r＝0.9995，n＝5），表明ISO檢測(cè)濃度線性范圍為1.12～7.84 μg·mL－1。

2.2.4 精密度試驗(yàn)。取同一批供試品溶液（批號(hào)：090702），分別于同日及不同日各測(cè)定吸光度5次，結(jié)果日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.11%和2.63%，均小于5%，表明其精密度良好。2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)。精密吸取空白納米粒分散液1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，共9份，3份為1組。精密吸取不同體積ISO貯備液稀釋液，分別與空白納米粒分散液混合，無(wú)水乙醇定容，制備成低、中、高（2.24、4.48、6.72 μg·mL－1）3個(gè)濃度的樣品，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，紫外法測(cè)定ISO濃度。結(jié)果低、中、高3個(gè)濃度樣品的平均加樣回收率分別為99.54%、99.11%、100.2%，RSD分別為0.87%、1.62%、0.89%。

2.3 透析法測(cè)定包封率的方法建立

2.3.1 透析介質(zhì)及透析時(shí)間的確定[6]。分別以蒸餾水和2%泊洛沙姆188水溶液為透析介質(zhì)，各取20 mL置于50 mL三角錐瓶中，將2份裝有ISO-SLN水分散體1 mL的透析袋扎緊后，分別置于上述透析介質(zhì)中，于恒溫振蕩儀中（37 ℃，80 r·min－1）振搖，分別于2、4、6、8、10、12、14、16 h精密吸取透析袋外液0.5 mL至5 mL容量瓶中，以無(wú)水乙醇定容，0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾，紫外法測(cè)定藥物濃度。同時(shí)，各透析介質(zhì)補(bǔ)加0.5 mL。以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，游離藥物濃度c為縱坐標(biāo)作圖，見圖2。

圖2 采用不同透析介質(zhì)時(shí)ISO濃度-時(shí)間曲線Fig 2 Concentration-time curves of ISO using different dialysis medium

由圖2可見，以2%泊洛沙姆188水溶液為透析介質(zhì)，透析袋外液藥物濃度于8 h左右達(dá)到最大值，10～16 h透析袋藥物濃度不再變化，說(shuō)明透析已經(jīng)達(dá)到平衡。因此，透析介質(zhì)確定為2%泊洛沙姆188水溶液，透析時(shí)間定為8 h。

2.3.2 ISO加樣回收率考察。精密吸取一系列不同濃度的ISO溶液，分別與空白納米粒分散液混合，得標(biāo)準(zhǔn)混合液。移取該標(biāo)準(zhǔn)混合液1 mL置于透析袋內(nèi)，2%泊洛沙姆188水溶液20 mL加于透析袋外，攪拌透析袋外液，透析8 h后，移取適量透析外液，紫外法測(cè)定濃度c1，計(jì)算總游離藥物質(zhì)量m1。以相同的透析條件測(cè)定ISO-SLN游離藥物濃度c2，計(jì)算游離藥物質(zhì)量m2。按回收率（%）＝（m1－m2）/m×100%（m為ISO理論加入量）計(jì)算回收率。結(jié)果，ISO的加樣回收率大于95%，符合ISO-SLN包封率測(cè)定的要求。

2.3.3 透析法測(cè)定包封率。取3批ISO-SLN 1 mL置于透析袋內(nèi)，兩端扎緊，置于20 mL透析介質(zhì)中，透析8 h后，移取透析袋外液適量，紫外法分別測(cè)定游離藥物濃度cf；另取未透析的ISO-SLN水分散體0.2 mL置于10 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇消解定容，紫外法測(cè)定藥物的總濃度ct，按包封率＝（ct×50－cf×21）（/ct×50）×100%公式計(jì)算得平均包封率為80.2%，RSD＝3.43%。

3 討論

在測(cè)定藥物包封率的方法中，分離的方法主要有離心法、透析法、凝膠柱層析法，各具特點(diǎn)。本研究依據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有條件，結(jié)合包封率測(cè)定方法的特點(diǎn)，建立透析法測(cè)定ISO-SLN的包封率，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，更適合ISO-SLN制備工藝優(yōu)化時(shí)包封率的測(cè)定。

以水作透析介質(zhì)，透析袋內(nèi)、外液滲透壓大，促進(jìn)水進(jìn)入透析袋內(nèi)，稀釋ISO-SLN水分散體，導(dǎo)致游離藥物的透析速度慢及納米粒滲透；以2%泊洛沙姆188為制備納米粒時(shí)的外水相，并以其水溶液為透析介質(zhì)，可以保證透析袋內(nèi)、外液滲透壓相同，游離藥物順濃度梯度透析，透析速度快，6 h即基本達(dá)到透析平衡。因此，為保證透析完全，本試驗(yàn)確定2%泊洛沙姆188水溶液為透析介質(zhì)，透析時(shí)間為8 h。

[1]Takahashi T，Babaa M，Nishinob H.Cyclooxygenase-2 plays a suppressive role for induction of apoptosis in isoliquiritigenin-treated mouse colon cancer cells[J].Cancer Letters，2006，231（3）：319.

[2]Li T，Satomi Y，Katoh D，et al.Induction of cell cycle arrest and p21CIP1/WAF1expression in human lung cancer cells by isoliquiritigenin[J].Cancer Letters，2004，207（1）：27.

[3]Kanazawa M，Satomi Y，Mizutani Y，et al.Isoliquiritigenin inhibits the growth of prostate cancer[J].Eur Urol，2003，43（5）：580.

[4]宋金春，鄧睿園，夏亞子，等.姜黃素固體脂質(zhì)納米粒制備工藝研究[J].中國(guó)藥房，2009，20（18）：1383.

[5]曾 嶸，周知午，吳翠芳，等.藍(lán)萼甲素固體脂質(zhì)納米粒的制備及理化性質(zhì)研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（9）：666.

[6]王新春，侯世祥，李 文，等.白藜蘆醇小麥醇溶蛋白納米粒包封率測(cè)定方法的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（13）：1355.