聯(lián)苯芐唑乳膏體外經(jīng)皮透過評價試驗

郜琪臻，劉 慧，趙亞囡，丁平田*

聯(lián)苯芐唑是一種新型的氮取代性不含鹵素的咪唑類局部抗真菌藥，該藥物抗菌譜廣、抗菌活性高、皮膚滲透力強、療效確切、作用持久、且毒性低［1］。本藥能很好地透過被感染的皮膚，作用迅速且持續(xù)時間長，維持時間超過48 h。由于真菌菌絲可侵入角質(zhì)層深部，因此，抗真菌藥制劑的療效與其經(jīng)皮滲透能力有關(guān)。本試驗以小型豬全皮皮膚為模型，應(yīng)用改良的Franz立式擴散池，對受試聯(lián)苯芐唑進(jìn)行了體外經(jīng)皮透過評價。

1 實驗材料

1.1 儀器 透皮擴散試驗儀(TK-12B型)，上海鎧凱科技貿(mào)易有限公司;改良的Franz立式擴散池(有效透過面積3.14 cm2，接受池體積:7 mL，上海鎧凱科技貿(mào)易有限公司);HPLC色譜儀(SPD-10AVP)，日本島津;HPLC工作站，YL-clarity(韓國)。

1.2 材料 聯(lián)苯芐唑原料藥(重慶青陽藥業(yè)有限公司，批號:090505，含量99.1%;由濟(jì)南三源藥業(yè)有限公司提供);對照市售聯(lián)苯芐唑乳膏(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號:BAT/115976);受試聯(lián)苯芐唑乳膏(濟(jì)南三源藥業(yè)有限公司，批號:20091027);生理鹽水注射液(黑龍江七臺河制藥廠，批號:081225101);其余試劑為市售色譜純。小型豬(巴馬香豬，雄性)，由重慶宗申醫(yī)達(dá)生物技術(shù)研發(fā)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2010-0001。動物使用證:SYXK(渝)2010-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 離體皮膚的制備 將小型豬處死，機械法剪毛，剝?nèi)∑つw，切皮刀除去多余的脂肪組織，用生理鹽水洗干凈，放置冰箱(－70℃)中冷藏，備用。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱:Chromatorex C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.08 mol/L三乙胺(用磷酸調(diào)pH值為7.0)∶乙腈∶甲醇 =15∶17∶68;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:254 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2.3 空白樣品的干擾試驗 取離體小型豬皮膚，按透皮試驗方法進(jìn)行試驗，但是給藥池中不加藥物，以生理鹽水為接受液時，取試驗2、10 h的接受液;以PEG400∶生理鹽水(1∶2)為接受液時，取試驗2、10 h的接受液，過濾后進(jìn)樣測定，HPLC圖譜見圖1～圖3。

圖1 生理鹽水為接受液時空白樣品10 h

圖2 PEG400∶生理鹽水(1∶2)為接受液時空白樣品10 h

圖3 聯(lián)苯芐唑標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰

由圖3可見，聯(lián)苯芐唑保留時間為7.87 min，而空白樣品溶液在此保留時間無吸收，說明輔料不干擾聯(lián)苯芐唑測定。由圖3計算得到柱效為5 800，高于藥典規(guī)定的700，符合要求。

2.4 最低檢測限 采用企業(yè)提供的聯(lián)苯芐唑原料藥為工作對照品，精密稱取0.050 6 g(含量99.1%，相當(dāng)于聯(lián)苯芐唑0.050 1 g)，加甲醇溶解稀釋成濃度為50 μg/mL的溶液，逐步稀釋，進(jìn)樣測定，選取HPLC圖譜基線噪音3倍者作為最低檢測限，進(jìn)樣濃度:0.001 μg/mL，最低檢測限 =0.001 μg/mL ×20 μL=2 ×10－5μg。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 利用最低檢測限下配置的50 μg/mL聯(lián)苯芐唑?qū)φ掌?，用甲醇逐步稀釋配制?1、5、10、25、40 μg/mL 的溶液。每一濃度進(jìn)樣2次進(jìn)行測定。以對照品的峰面積(A)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=38.541 C+7.075 3(r=0.999 9)。結(jié)果，聯(lián)苯芐唑檢測濃度的線性范圍為1～40 μg/mL。濃度大于該范圍的樣品用接收介質(zhì)稀釋后，進(jìn)樣測定。

2.6 回收率試驗 用甲醇稀釋配制 5、25、50 μg/mL聯(lián)苯芐唑溶液，每種濃度分別配3份，按色譜條件每種濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算藥量，計算回收率，回收率在98% ～102%之間，見表1。

表1 回收率測定結(jié)果(n=9)

2.7 精密度試驗 回收率測定所用樣品溶液，每種濃度測定3次，計算高、中、低不同濃度的精密度，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示精密度良好。

表2 精密度測定結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗 取聯(lián)苯芐唑試驗樣品溶液(50.1 μg)，于室溫下放置，并于 0、2、3、4、5 h 按以上色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，聯(lián)苯芐唑峰面積無明顯變化，表明樣品溶液在5 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見表3。

表3 樣品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.9 體外經(jīng)皮擴散試驗

2.9.1 接受介質(zhì)的確定 在體外經(jīng)皮試驗中，文獻(xiàn)中最常用的接受液是生理鹽水和磷酸鹽緩沖液(PBS)，理想的接受介質(zhì)應(yīng)當(dāng)可以準(zhǔn)確模擬被測化合物的體內(nèi)經(jīng)皮吸收條件。一般來說，在接受液中，藥物的濃度不能超過其飽和溶解度的10%(即應(yīng)該滿足漏槽條件)，接受液濃度過高能導(dǎo)致吸收速率降低，進(jìn)而導(dǎo)致過低估計了其在體吸收。一般認(rèn)為，一個化合物在某水性溶液中的溶解度如果低于10 μg/mL，則不能用該溶液做接受液，有必要在接受介質(zhì)中加入增溶劑［14］。

因為聯(lián)苯芐唑是難溶性藥物，因此，我們首先考察藥物在生理鹽水、丙二醇∶生理鹽水(1∶2)以及PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中的溶解度，以確定接受介質(zhì)。

稱取聯(lián)苯芐唑原料藥約1 g，至30 mL磨口三角瓶中，加入接受液25 mL，使溶液中始終保持有固體藥物存在，將此溶液置于37℃恒溫水浴中，100 rpm磁力攪拌，定時取樣1 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，進(jìn)樣20 μL用HPLC測定含量，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算聯(lián)苯芐唑的濃度，超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的樣品，用各自接受介質(zhì)稀釋后進(jìn)樣測定。每種介質(zhì)平行做2份試驗。分別測定3、5、10 h的溶解度，以確定所選的介質(zhì)是否可以滿足漏槽條件。聯(lián)苯芐唑在PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度稀釋20倍后進(jìn)樣測定。見表4。

表4 聯(lián)苯芐唑在生理鹽水及丙二醇∶生理鹽水(1∶2)、PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度(37℃，μg/mL)

由表4可見，聯(lián)苯芐唑在丙二醇∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度約為2 μg/mL;在生理鹽水中的溶解度約為1 μg/mL;在PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中約為 400 μg/mL(＞10 μg/mL)。由于聯(lián)苯芐唑在丙二醇∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度很低，不符合漏槽條件，筆者選用生理鹽水和PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液作為透皮吸收的接受液，分別考察藥物的經(jīng)皮透過性。

2.9.2 透皮試驗 采用改良的Franz立式擴散池進(jìn)行試驗，本法是目前文獻(xiàn)中較常見的局部用制劑的體外透過性研究方法，一般認(rèn)為是一種簡單、重現(xiàn)性好的試驗方法［2］。

擴散池由給藥池和接收池組成，將皮膚固定在供給池與接收池之間，將角質(zhì)層面向給藥池一側(cè)，供給池中加入被測制劑(聯(lián)苯芐唑乳膏0.5 g)，輕輕涂抹，使乳劑均勻分布于皮膚上。接收池中加入7 mL的接受液，供給池底部凹槽中放入磁力攪拌子，攪拌速度100 rpm，溫度(37±0.5)℃。開始試驗后，于1、2、3、4、6、8、10 h 定時取樣，每次吸取2 mL接受液，隨即補等量的接受液，樣品溶液過濾后，利用HPLC測定藥物濃度。按分析方法項下色譜條件進(jìn)樣，測得峰面積后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，再根據(jù)接受池液體積和有效擴散面積，按下面的公式計算單位面積(cm2)的累積透皮量(Qn)。

式中，Ci為第i點測得的藥物濃度(μg/mL);V為接受池液的總體積(7.0 mL);Vi為每次取樣的體積(2.0 mL);S為滲透面積(3.14 cm2)。受試聯(lián)苯芐唑乳膏和對照聯(lián)苯芐唑乳膏(市售)分別以生理鹽水、PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液測定經(jīng)皮透過性。在生理鹽水接受液的條件下，對照聯(lián)苯芐唑乳膏樣品和受試樣品均不能透過離體的小型豬皮膚。在 PEG400∶生理鹽水(1∶2)接收液條件下有微量透過，試驗結(jié)果見表5～表8;可以看出，10 h的累積透過量受試聯(lián)苯芐唑乳膏為(0.286±0.100)μg/cm2，對照聯(lián)苯芐唑乳膏為(0.269±0.033)μg/cm2;二者經(jīng)皮透過曲線基本一致，見圖4。所以，可以證明受試聯(lián)苯芐唑乳膏和對照聯(lián)苯芐唑乳膏在經(jīng)皮透過性上沒有差異。

表5 受試聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮透過性測定結(jié)果［PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液，μg/mL］

表6 受試聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮累積透過量［PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液，μg/cm2］

表7 對照聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮透過性測定結(jié)果［PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液，μg/mL］

3 討論

中國藥典2005年版用甲醇∶水∶四氫呋喃(體積比為84∶5∶1)作測定乳膏中聯(lián)苯芐唑的流動相，并規(guī)定了理論塔板數(shù)不得低于700。實驗中發(fā)現(xiàn)采用這一流動相測定時，聯(lián)苯芐唑的最低檢測限0.01 μg(0.5 μg/mL ×20 μL)，不夠靈敏且色譜峰變寬。因此，本文本試驗參照文獻(xiàn)［3-6］，并經(jīng)試驗確定，以pH7.0三乙胺磷酸鹽緩沖液∶乙腈∶甲醇(15∶17∶68)為流動相，采用ODSC18色譜柱，可有效減少ODS色譜柱硅醇基引起的藥物拖尾現(xiàn)象，而且測試時間相對較短。

表8 對照聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮累積透過量［PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液，μg/cm2］

圖4 聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮透過性測定曲線(PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液)

透皮實驗中，接受介質(zhì)的確定是較關(guān)鍵的一步。在接受液中，藥物濃度應(yīng)滿足漏槽條件。由于聯(lián)苯芐唑是難溶藥物，本實驗首先考察藥物在生理鹽水、丙二醇∶生理鹽水(1∶2)以及PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中的溶解度，以確定接受介質(zhì)。實驗時，注意使溶液中始終保持有固體藥物存在，即確保溶液達(dá)到飽和狀態(tài)。溶解度大的介質(zhì)(PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液)可以滿足漏槽條件;雖然聯(lián)苯芐唑在生理鹽水中的溶解度很低，只有1 μg/mL左右，但是在透過性試驗中證明并沒有藥物透過，所以也符合漏槽條件，而且生理鹽水中因為沒有添加外來物質(zhì)，更能代表在體的真實情況，因此，選擇這兩種介質(zhì)合理可行。

［1］ 羅東輝，袁承晏.聯(lián)苯芐唑的藥效學(xué)研究實驗室抗真菌活性測定［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1990，15(4):26.

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［3］ 榮蓉，陳繼平，劉淑琴，等.聯(lián)苯芐唑乳膠劑的制備及質(zhì)量考察［J］.中國藥劑學(xué)雜志，2008，6(5):219.

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