鹽酸洛美沙星大鼠在體腸吸收動力學(xué)研究

鄭雪靜，趙慶春 ，顏 鳴，鄭永昌，程 剛

鹽酸洛美沙星為第三代喹喏酮類廣譜抗菌藥物，該藥抗菌活性強，對革蘭陽性菌的抗菌活性與諾氟沙星相同，強于依諾沙星;對革蘭陰性菌的作用與依諾沙星相同，毒性低，廣泛用于治療敏感細菌引起的呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)、胃腸道、皮膚軟組織等感染。由于大鼠腸道吸收特點與人體吸收的相關(guān)性已經(jīng)由許多實驗得到證實，為探討鹽酸洛美沙星在不同腸段的吸收特征，指導(dǎo)口服類劑型的設(shè)計，本文采用大鼠在體腸吸收試驗方法［1］，對鹽酸洛美沙星的吸收部位和吸收動力學(xué)進行研究，希望對劑型設(shè)計提供可靠的生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

Waters501高效液相色譜儀(美國Waters公司);UV-2501PC紫外分光光度計(島津);Sartorius普及型pH計(pB-10)，德國賽多利斯股份有限公司);離心機:TBL-16B高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);AUW120D島津分析天平;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);恒流泵:EYELA CERAMIC PUMP VSP-3050(VSP-3050型中壓柱層析，日本東京理化株式會社)。鹽酸洛美沙星(南通林港有限公司);酚紅(天津市博迪化工有限公司);烏拉坦(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司);Kreb-Ringer's營養(yǎng)液［2］(簡稱 K氏液，自配，每1 000 mL內(nèi)含有 NaCl 7.80 g;KCl 0.35 g;NaHCO31.37 g;NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，葡萄糖 1.40 g);其他試劑均為分析純。雄性Wister大鼠，體質(zhì)量(250±20)g(沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心，合格證號:遼實動質(zhì)字2003-008)。

2 方法

2.1 腸循環(huán)液中酚紅的濃度測定

2.1.1 酚紅標準曲線的建立 精密吸取Kreb-Ringer's營養(yǎng)液，配制含酚紅濃度為10、20、30、40、50 μg/mL系列標準液，分別吸取0.5 mL加入0.2 mol/L NaOH溶液5 mL顯色，在波長558 nm處，以0.2 mol/L NaOH為空白對照，測定吸收度A值。以吸收度A對酚紅濃度C做線性回歸，得標準曲線方程:A=0.017 6 C+0.014 8，R2=0.999 6。

2.1.2 腸循環(huán)液中酚紅濃度的測定 取大鼠在體腸循環(huán)液在不同時間點的樣品，分別吸取0.5 mL，加入0.2 mol/L NaOH溶液5 mL顯色，以0.2 mol/L NaOH為空白，在558 nm處測定吸光度A，代入標準曲線方程求得酚紅濃度。

2.2 腸循環(huán)液中鹽酸洛美沙星濃度的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:DiamonsilTMC18(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.02 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH至2.6)∶乙腈(體積比 85∶15)檢測波長:287 nm;進樣量:20 μL;流速:1 mL/min;柱溫:室溫。分別取空白腸循環(huán)液(即加入酚紅K氏液進行大鼠小腸循環(huán)灌注2 h)、鹽酸洛美沙星對照液及樣品溶液(腸循環(huán)液)，按“2.2.1”色譜條件下測定。結(jié)果表明，鹽酸洛美沙星保留時間約為12 min，樣品液的主峰保留時間與對照液一致，空白腸循環(huán)液對測定無干擾。

2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取鹽酸洛美沙星貯備液適量，用含有酚紅20 μg/mL的K氏液稀釋含鹽酸洛美沙星濃度為 20、30、50、100、150、200 μg/mL系列的鹽酸洛美沙星溶液，在上述色譜條件下，以峰面積A對濃度C進行線性回歸，得標準曲線方程:A=2.298 7×104C－105 23，r=0.999 6(n=6)。

2.2.3 腸循環(huán)液中鹽酸洛美沙星的濃度測定在不同時間點取大鼠在體腸循環(huán)液樣品續(xù)濾液20 μL，注入高效液相色譜儀，代入“2.2.2”項下標準曲線，計算鹽酸洛美沙星的濃度。

2.3 大鼠在體腸循環(huán)液實驗

2.3.1 供試液的配制 精密稱取酚紅20 mg于1 000 mL量瓶中，用K氏液溶解并定容，得空白腸循環(huán)液。稱取鹽酸洛美沙星約100 mg于1 000 mL上述腸循環(huán)液中，充分攪拌使藥物溶解，過0.45 μm的微孔濾膜，避光冷藏作為貯備液。將貯備液以空白腸循環(huán)液稀釋一定倍數(shù)，吸取20 μL進行液相色譜分析，測定藥物峰面積，代入“2.2.2”項下標準曲線方程，計算貯備液中藥物濃度。在腸吸收實驗之前，根據(jù)測定結(jié)果量取適量貯備液，以空白腸循環(huán)液配制成不同濃度以及不同pH值的鹽酸洛美沙星供試液。

2.3.2 腸吸收試驗方法［3］選擇實驗前禁食12 h(不禁水)的大鼠，腹腔注射20%烏拉坦溶液(1.0 g/kg)麻醉后固定。沿腹中線切開腹腔，在實驗?zāi)c段兩端各切一小口，在上下兩端小口處各插入玻璃管，并用手術(shù)線固定。用37℃生理鹽水緩緩注入腸管，洗凈腸段內(nèi)容物。用硅膠管將腸段兩端的玻璃管與蠕動泵及供試液連接，形成回路，開動蠕動泵。取預(yù)熱的37℃供試液200 mL，先以5 mL/min流速循環(huán)10 min后，將流速調(diào)節(jié)為2.5 mL/min進行回流，于回流 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 取回流液2 mL，同時補充等量的空白腸循環(huán)液。樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液0.5 mL，用紫外分光光度法測定酚紅濃度，取20 μL用于高效液相分析，測定鹽酸洛美沙星的濃度。分別考察各腸段區(qū)間如下:十二指腸段自幽門1 cm處開始;空腸距幽門15 cm處開始;回腸段自盲腸上行20 cm處開始;結(jié)腸段從盲腸后段開始;腸段區(qū)間均取10 cm。整腸段自十二指腸上端起到回腸下端止。

2.3.3 鹽酸洛美沙星在腸循環(huán)液中穩(wěn)定性考察

取20 mL鹽酸洛美沙星供試液于循環(huán)裝置中，在同樣實驗條件下循環(huán)，分別在0、1、2、3、4 h取樣，按照“2.2.2”項下操作測定鹽酸洛美沙星的在腸循環(huán)液中含量變化。

3 結(jié)果

3.1 腸循環(huán)液中藥物濃度的方法學(xué)結(jié)果 酚紅測定方法的回收率和精密度:酚紅低、中、高3個濃度(10、20、30 μg/mL)，平均回收率為 99.82%、99.39%、100.22%(n=5)，精密度 RSD分別為0.18%、0.33%、0.29%(n=5)。

鹽酸洛美沙星測定方法的回收率和精密度:鹽酸洛美沙星低、中、高 3個濃度(1.5、15、150 μg/mL)，平均回收率為 98.93%、99.20%、100.10%(n=5);精密度 RSD分別為0.28%、0.35%、0.13%(n=5);日內(nèi)精密度 RSD為0.38%、0.45%、0.36%(n=5);日間精密度RSD為0.42%、035%、0.46%(n=5)。結(jié)果表明，測定方法回收率和精密度均符合要求，證明該方法適用于藥物含量測定。

3.2 鹽酸洛美沙星在腸循環(huán)液中穩(wěn)定性 鹽酸洛美沙星在腸循環(huán)液中含量沒有明顯變化，穩(wěn)定性良好(RSD=1.15%)。

3.3 在體腸吸收動力學(xué)研究結(jié)果及影響因素

3.3.1 數(shù)據(jù)處理方法［4］吸收百分率:通過測定吸收前后供試液中藥物濃度的變化，計算藥物總的減少值，以求得小腸對藥物的吸收量。由于小腸對藥物吸收的同時也吸收水分，因此，供試液中加入不被吸收的酚紅，根據(jù)酚紅的濃度可以矯正供試液體積的變化，以便準確求出藥物總量的變化。藥物吸收百分率按以下公式進行計算:

式中:C0:原供試液中藥物的濃度(μg/mL);V0:原供試液體積(mL);C0':原供試液中酚紅的濃度(μg/mL);C1':回流4 h后循環(huán)液中酚紅的濃度(μg/mL);C1:回流4 h后循環(huán)液中藥物的濃度(μg/mL)。

吸收百分數(shù)速率常數(shù):以每一時刻循環(huán)液中剩余藥量均值的對數(shù)對時間做圖，得一條直線，說明藥物吸收為表觀一級速度過程?？砂匆韵鹿接嬎?

式中:lnX和lnX0分別表示循環(huán)液中剩余藥量和原供試液中藥量的對數(shù)值，Ka表示吸收速率常數(shù)，t表示時間。

3.3.2 各腸段吸收速率常數(shù)及吸收百分數(shù) 見表1。配制20 μg/mL供試液，分別在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸回流4 h，并于規(guī)定時間取樣。以各取樣點剩余藥量取對數(shù)值對時間做圖，根據(jù)斜率求出各腸段吸收速率常數(shù)Ka，并求得回流4 h的吸收百分數(shù)。結(jié)果見表1。可知，十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收速率常數(shù)和吸收百分率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并按照空腸＞十二指腸＞回腸＞結(jié)腸的順序依次降低。

表1 鹽酸洛美沙星在大鼠各腸段的吸收速率常數(shù)及吸收百分數(shù)(±s，n=5)

表1 鹽酸洛美沙星在大鼠各腸段的吸收速率常數(shù)及吸收百分數(shù)(±s，n=5)

部位 吸收(%) Ka(h－1)十二指腸20.2 0.204 5±0.034 4空腸 23.3 0.321 0±0.045 8回腸 16.3 0.183 9±0.038 2結(jié)腸12.4 0.129 2±0.045 3

3.3.3 不同藥物濃度對腸吸收的影響 見表2。

表2 不同濃度鹽酸洛美沙星的腸吸收速率常數(shù)及吸收百分數(shù)(±s，n=5)

表2 不同濃度鹽酸洛美沙星的腸吸收速率常數(shù)及吸收百分數(shù)(±s，n=5)

濃度(μg/mL) 吸收(%) Ka(h－1)1.5 20.28±2.810 0.192 7±0.091 2 15.0 24.27±2.919 0.219 2±0.032 1 150.0 28.22±3.190 0.230 9±0.048 2

由表2可知，在1.5～150 μg/mL內(nèi)藥物的吸收量和質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，吸收速率常數(shù)幾乎保持不變，表明藥物吸收是被動擴散的結(jié)果。

3.3.4 不同pH值對腸吸收的影響 見表3。由表3可知，對不同pH值條件下吸收速率常數(shù)進行方差分析，結(jié)果表明，溶液的pH值對小腸吸收基本無影響。

表3 不同pH值下鹽酸洛美沙星的腸吸收速率常數(shù)及吸收百分數(shù)(±s，n=5)

表3 不同pH值下鹽酸洛美沙星的腸吸收速率常數(shù)及吸收百分數(shù)(±s，n=5)

pH值 吸收(%) Ka(h－1)6.29 20.23±2.181 0.163 1±0.029 2 6.79 22.21±2.902 0.181 9±0.023 1 7.40 18.29±1.931 0.160 2±0.031 1

4 討論

4.1 藥物濃度測定方法的選擇 采用在體腸吸收實驗來研究鹽酸洛美沙星在大鼠腸道內(nèi)的吸收動力學(xué)特征，方法簡便、快捷，不損傷大鼠的血管及神經(jīng)，可以有效模擬藥物在腸道不同部位的吸收情況。由于酚紅不被腸壁所吸收，可以用來測定小腸對水分的吸收，進而計算腸循環(huán)液中藥物濃度的變化。本實驗中藥物濃度的測定采用高效液相色譜法，與常規(guī)的雙波長法比較，測定結(jié)果準確、可靠。

4.2 藥物的吸收機制 本實驗結(jié)果表明，藥物濃度及pH值對藥物吸收幾乎無影響，小腸吸收速率常數(shù)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，所以鹽酸洛美沙星的大鼠腸吸收屬于一級動力學(xué)過程［5］，吸收機制為被動擴散。但是各腸段之間的吸收差異有統(tǒng)計學(xué)意義，藥物在全小腸段的吸收良好，而在結(jié)腸段的吸收較差，從而為鹽酸洛美沙星的劑型設(shè)計奠定基礎(chǔ)。

4.3 實驗結(jié)果對劑型設(shè)計的指導(dǎo)意義 胃腸道吸收機制的研究是處方前的重要工作，能夠指導(dǎo)人們根據(jù)藥物的吸收機制和吸收部位特點選擇合適的劑型，保證和提高藥物制劑的生物利用度，從而減少劑型設(shè)計的盲目性。本實驗中鹽酸洛美沙星在大鼠全腸段均有吸收，吸收符合一級動力學(xué)特征，吸收機制為被動轉(zhuǎn)運。

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［4］ 陶秀梅，唐星.利巴韋林大鼠腸吸收動力學(xué)［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2004，21(6):401-404.

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