PRRSV GP5蛋白抗獨特型單鏈抗體的構(gòu)建表達(dá)及鑒定

于 穎，王 剛，宋騰飛，孔 寧，馬曉春，姚永紅，肖一紅*，周恩民,2*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(Porcine reproducitive and respiratory syndrome virus，PRRSV)為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)，含有6個結(jié)構(gòu)蛋白。其中表面蛋白(GP5)和基質(zhì)蛋白(Matrix)可能是誘導(dǎo)中和抗體的主要病毒抗原[1]。

獨特型(Idiotype，Id)是存在于抗體和T，B淋巴細(xì)胞表面受體可變區(qū)(V)內(nèi)的抗原決定簇。Jerne提出的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為，機體內(nèi)通過一系列Id和其抗獨特型(Anti-Id或Ab-2)的正反饋或負(fù)反饋來調(diào)節(jié)機體對某一抗原的免疫反應(yīng)[2]。感染了PRRSV的豬血清中有兩種不同的抗GP5的自身抗獨特型抗體(auto-Ab2)，在針對PRRSV感染的免疫網(wǎng)絡(luò)中起到正向或負(fù)向調(diào)控作用[3-4]。本實驗室前期采用順序免疫法制備的針對PRRSV GP5抗原的MAb2-5G2可以特異性結(jié)合PAM和MA-104細(xì)胞[5]。MAb2-5G2通過正反饋調(diào)控機體對抗PRRSV感染的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，提高感染高致病性PRRSV的斷奶仔豬成活率達(dá)50%以上。本研究構(gòu)建表達(dá)了MAb2-5G2的scFv，并證明該scFv可以被兔抗MAb2-5G2抗體，即Ab3識別，復(fù)性后的scFv蛋白能夠特異性結(jié)合Marc-145細(xì)胞。為進(jìn)一步深入研究其所識別的細(xì)胞蛋白與PRRSV感染細(xì)胞的關(guān)系及在豬體內(nèi)調(diào)控免疫系統(tǒng)抵抗PRRSV的感染提供了條件。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑 鼠源雜交瘤細(xì)胞MAb2-5G2由本實驗室制備；E.coliTop10、BL21 Rosetta菌株由本室保存；pEasy-E1載體、DNA Marker、TransTaq HiFi DNA聚合酶和鼠源抗His單克隆抗體(MAb)購自北京全式金公司；TRIzol試劑和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen；CNBr活化的瓊脂糖凝膠6MB購自GE公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗均購自北京康地恩公司。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)鼠源抗體基因家族可變區(qū)的骨架區(qū)(FR)和互補決定區(qū)(CDR)氨基酸序列特點及文獻(xiàn)[6]，設(shè)計并合成擴增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的引物。分別在重鏈可變區(qū)基因的下游引物和輕鏈可變區(qū)基因的上游引物以重疊基因的形式設(shè)計連接子以便連接(表1)。

表1 PCR引物名稱及序列Table 1 Primers used for the PCR and RT-PCR

1.3 兔抗MAb2-5G2抗體(Ab3)的制備 2只體質(zhì)量為2.0 kg的新西蘭大白兔，每只各免疫2 mg MAb2-5G2，每兩周免疫一次，共免疫3次，3次免疫后收集兔血清備用。分別將MAb2-5G2和無關(guān)IgG偶聯(lián)到CNBr活化的瓊脂糖凝膠上制備成免疫親和層析柱[7]。將免疫后兔血清通過偶聯(lián)無關(guān)鼠源IgG的免疫親和柱除掉抗Fc抗體，收集未結(jié)合抗體柱的液體經(jīng)偶聯(lián)MAb2-5G2的抗體柱得到特異性結(jié)合MAb2-5G2可變區(qū)的抗體，即Ab3。

1.4 抗體可變區(qū)基因的擴增及陽性克隆的篩選鑒定采用TRIzol法提取MAb2-5G2雜交瘤細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以cDNA為模板，分別利用引物HF、HB和LF、LB通過RT-PCR擴增重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因VL。VH和VL基因PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與pMD18-T連接轉(zhuǎn)化至E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞中，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽性后測序鑒定。

1.5 scFv重疊PCR擴增及其原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以膠回收的VH和VL基因片段互為模板進(jìn)行PCR擴增。 PCR反應(yīng)體系為50 μL：VH和VL模板各 1 μL，dNTPs(2.5mmol/L)4 μL，10×Trans TaqHiFi Buffer 5 μL，TransTaqHiFi DNA 聚合酶0.5 μL，去離子水38.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃5 min；94℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 1 min，7個循環(huán)；加入引物HF和LB各1 μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃30 s、58℃1 min、72℃1 min，18個循環(huán)；72℃10 min。擴增的scFv目的片段經(jīng)膠回收純化后與pEasy-E1連接，轉(zhuǎn)化至E.coliTop10中。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定為陽性后測序，重組質(zhì)粒命名為pEasy-scFv。

1.6 pEasy-scFv的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將pEasy-scFv轉(zhuǎn)化BL21 Rosetta感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)0.5 mol/mL的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，超聲裂解，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。表達(dá)蛋白進(jìn)行Ni-resin純化。

1.7 重組scFv蛋白的復(fù)性及鑒定

1.7.1 重組蛋白的pH和尿素雙梯度復(fù)性 純化后的scFv蛋白包涵體用尿素梯度為8 mol/L～2 mol/L及pH梯度為6～8.5的復(fù)性溶液在16℃條件下進(jìn)行雙梯度透析復(fù)性，每個梯度透析12 h進(jìn)行復(fù)性。

1.7.2 Western blot鑒定 SDS-PAGE電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別用鼠源抗His的MAb和兔源抗體Ab3為一抗(經(jīng)純化的針對MAb2-5G2可變區(qū)的抗體)，分別以HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗進(jìn)行western blot分析鑒定，同時設(shè)空載體重組菌為陰性對照。

1.7.3 IFA鑒定復(fù)性scFv蛋白的活性 將Marc-145細(xì)胞鋪板后固定；各20 μg的MAb2-5G2、復(fù)性的scFv、未復(fù)性的scFv分別加入A、B、C孔中孵育；B和C孔中再加入鼠抗His MAb作為一抗；最后加入FITC羊抗鼠抗體進(jìn)行熒光分析鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增可變區(qū)基因 以反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示VH和VL分別在390 bp左右出現(xiàn)特異性片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。

圖1 VH和VL基因的擴增Fig.1 Amplification of VH and VL genes

2.2 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以純化后的VH和VL基因互為模板，利用VH 3'端和VL 5'端的引物上的重疊基因通過重疊PCR擴增得到scFv基因(圖2)。將scFv片段與pEasy-E1連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pEasy-scFv，測序結(jié)果表明scFv為762 bp。

圖2 SOE法擴增scFv基因Fig.2 Amplification of scFv gene by SOE-PCR

2.3 scFv基因誘導(dǎo)表達(dá) pEasy-scFv經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白(scFv-His)約30 ku。經(jīng)Ni-Resin純化后的重組蛋白與預(yù)測相符(圖3)。

圖3 重組scFv的表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant scFv

2.4 重組蛋白scFv的復(fù)性及鑒定

2.4.1 重組蛋白scFv的western blot分析 SDS-PAGE電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，分別用鼠源抗His MAb和Ab3進(jìn)行western blot檢測。結(jié)果顯示，在分子量約30 ku處均出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，表明scFv得到了正確表達(dá)，可以被Ab3識別，且具有良好的反應(yīng)原性(圖4)。

圖4 重組scFv的western blot鑒定Fig.4 Western blot analysis of recombinant scFv

2.4.2 重組蛋白scFv的IFA鑒定 IFA結(jié)果顯示，陽性對照抗體(MAb2-5G2)和復(fù)性后的scFv蛋白(20 μg)具有相同結(jié)合Marc-145細(xì)胞的能力，而未復(fù)性的scFv蛋白不能結(jié)合Marc-145細(xì)胞(圖5)。

3 討論

圖5 重組scFv的IFA鑒定Fig.5 IFA analysis of recombinant scFv

scFv是利用連接肽把抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接成的具有抗原結(jié)合位點的最小的抗體片段。本實驗利用RT-PCR方法從分泌PRRSV抗獨特型抗體的雜交瘤細(xì)胞中克隆抗體可變區(qū)基因具有正確的小鼠抗體骨架區(qū)和互補決定區(qū)的結(jié)構(gòu)，與Ig-BLAST中小鼠抗體可變區(qū)基因同源性達(dá)90%以上。鑒于VH-linker-VL比VL-linker-VH的親和力高10倍以上[8-9]，本研究選用了Huston根據(jù)X射線晶體衍射分析抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)的15肽序列(Gly4Ser)3作為連接肽[10]，克隆出抗獨特型抗體單鏈抗體基因VH-linker-VL，并制備能夠保持該抗獨特型抗體親和性和特異性的scFv。該scFv蛋白質(zhì)量約為30 ku，能夠與兔抗MAb2-5G2抗體，即Ab3特異性結(jié)合。同時，復(fù)性的scFv蛋白經(jīng)過二硫鍵正確折疊保持了它與MAb2-5G2 IgG相同的識別PRRSV易感細(xì)胞Marc-145的結(jié)合能力。

目前，PRRS的防制主要依靠弱毒苗和滅活苗的接種。弱毒苗可提供良好的保護(hù)效力，但存在毒力返強的風(fēng)險，而滅活苗的效果并不穩(wěn)定[11-12]。MAb2-5G2可能作為PRRSV GP5的“內(nèi)影像”分子，既可模擬抗原表位而發(fā)揮免疫作用，又避免了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的缺點，具有潛在的應(yīng)用價值；而單鏈抗獨特型抗體與抗獨特型抗體相比，具有分子量小，無毒性，易于穿入組織細(xì)胞，易在大腸桿菌中大量表達(dá)的優(yōu)勢。我們在證明經(jīng)過復(fù)性的原核表達(dá)的scFv具備MAb2-5G2的免疫學(xué)功能的基礎(chǔ)之上，將繼續(xù)構(gòu)建MAb2-5G2 scFv的真核表達(dá)系統(tǒng)，通過真核表達(dá)的MAb2-5G2 scFv研制抗獨特型抗體疫苗及深入研究新型PRRSV受體與PRRSV感染宿主細(xì)胞的關(guān)系。

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