補充蒺藜提取物對過度訓(xùn)練大鼠T淋巴細(xì)胞亞群和NK、NKT細(xì)胞的影響

孫婧瑜 楊文吉 王茹 曲靜 游盛中 王曉慧

上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院（上海 200438）

過度或激烈運動會降低機(jī)體免疫力，出現(xiàn)運動性免疫抑制（exercise-related immunosuppression），所以訓(xùn)練或比賽后常有運動員抵抗力下降，出現(xiàn)感染性疾病，如上呼吸道感染、病毒性肝炎等，影響其運動能力，甚至停訓(xùn)停賽。因此尋找合適的解決方法避免或改善運動性免疫功能抑制，對提高運動員運動能力具有重要意義。

蒺藜有草中名藥之稱，它含有皂苷類、黃酮類和甾醇類等化合物，皂苷是蒺藜的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蒺藜皂苷有性強(qiáng)壯、降血壓、降血脂和抗動脈粥樣硬化等作用［1］。關(guān)于蒺藜調(diào)控免疫功能及其機(jī)制的相關(guān)研究剛開展，有限的研究認(rèn)為，蒺藜水提取物能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能［2］；蒺藜皂苷能增強(qiáng)機(jī)體自然殺傷細(xì)胞活性，預(yù)防老年人免疫功能降低［3］。蒺藜是否能改善過度運動所致的運動性免疫抑制尚無報道。本實驗選擇T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+/CD8+比值、輔助性T細(xì)胞（Th）1/Th2細(xì)胞平衡以及NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞數(shù)量等免疫學(xué)指標(biāo)，研究了蒺藜提取物對過度訓(xùn)練所致的運動性免疫抑制大鼠免疫功能的影響，以探討蒺藜提取物對過度訓(xùn)練導(dǎo)致的運動性免疫抑制的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，為開發(fā)蒺藜作為過度訓(xùn)練的免疫改善制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

30只健康雄性SD大鼠購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心［實驗動物使用許可證號SYXK（滬）2007－0003］，8周齡，隨機(jī)分為安靜對照組、過度訓(xùn)練組和蒺藜+過度訓(xùn)練組3組，每組10只。

1.2 實驗方法

1.2.1 訓(xùn)練方案

對照組不進(jìn)行任何運動訓(xùn)練。過度訓(xùn)練組和蒺藜＋過度訓(xùn)練組正式實驗前先進(jìn)行3天跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練。正式訓(xùn)練方案參照Bedford方法［4］改良，采用6周遞增強(qiáng)度運動訓(xùn)練，其強(qiáng)度、坡度和持續(xù)時間分別為15 m/min、5%、30 min（第1周）；20 m/min、5%、60 min（第2周）；25 m/min、10%、90 min（第3周）；30 m/min、15%、90 min（第4周）；30 m/min、15%、120 min（第5周）；35 m/min、15%、120 min（第6周）。每周訓(xùn)練6天，休息1天。

1.2.2 蒺藜提取物的補充方式

蒺藜提取物（含總皂苷60%以上）購自西安三維生物技術(shù)有限公司，將其配制成濃度為24 mg/ml的溶液。每次訓(xùn)練前30 min，過度運動+蒺藜組以120 mg/kg體重的劑量灌胃服用蒺藜提取物，對照組和過度訓(xùn)練組灌服等體積的生理鹽水。

1.2.3 取材及指標(biāo)檢測

體重檢測：每周一上午用天平稱量各組大鼠體重。

內(nèi)分泌激素檢測：第7周周一上午大鼠眼眶靜脈叢采血0.5 ml后用ELISA試劑盒（上海申能博采生物科技有限公司）檢測外周血皮質(zhì)酮（C）、睪酮（T）水平。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

免疫細(xì)胞檢測：第7周周一上午，使用肝素真空采血針抽取大鼠腹主靜脈血，并向100 μl抗凝血中加入20 μl抗體，混勻后25℃恒溫器中孵育1 h，溶紅細(xì)胞后放入恒溫器10～20 min，1500 r/ min離心5 min，取上清液用生理鹽水洗1～2次，1500 r/ min離心5 min后上流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司）檢測CD3+、CD4+、CD8+、NK、NKT細(xì)胞數(shù)及IFN-、IL-4分泌量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件包分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，過度訓(xùn)練組分別與安靜對照組和蒺藜+過度訓(xùn)練組比較，采用單因素方差分析，顯著性水平為P < 0.05，非常顯著性水平為P < 0.01。

2 結(jié)果

2.1 大鼠外觀狀態(tài)、體重及內(nèi)分泌指標(biāo)

過度訓(xùn)練組第4、5、6周各有1只大鼠死亡，原因不清；蒺藜+過度訓(xùn)練組第5周有2只死亡。實驗后期，過度訓(xùn)練組大鼠反應(yīng)遲鈍，精神萎靡不振，眼神暗淡無光，毛發(fā)脫落等，而蒺藜+過度訓(xùn)練組大鼠也出現(xiàn)相似表現(xiàn)，但程度比過度訓(xùn)練組輕。

表1顯示，實驗前（0周）各組大鼠體重?zé)o顯著性差異，從第3周開始過度訓(xùn)練組大鼠體重顯著低于安靜對照組（約是對照組的82%，P < 0.01），至第6周時約是對照組的76%（P < 0.01）。第4周和第6周蒺藜＋過度訓(xùn)練組大鼠體重與過度訓(xùn)練組比較顯著增加（P < 0.05），但仍顯著低于安靜對照組（P < 0.01）。

表1 3組大鼠實驗期間體重的變化

表2顯示，與過度訓(xùn)練組相比，蒺藜+過度訓(xùn)練組睪酮水平顯著增加（P < 0.05），皮質(zhì)酮水平顯著降低，約是過度訓(xùn)練組的一半，且低于安靜對照組（P < 0.05），T/C比值大幅增加，是安靜對照組的1.95倍（P < 0.01）。

表2 3組大鼠血漿睪酮、皮質(zhì)酮及T/C比值比較

2.2 免疫指標(biāo)

2.2.1 CD3+細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+比值

表3顯示，蒺藜＋過度訓(xùn)練組大鼠CD+/CD+48比值顯著增加，遠(yuǎn)超過安靜對照組，是其水平的2.04倍。蒺藜＋過度訓(xùn)練組大鼠CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量與過度訓(xùn)練組比較雖有增加趨勢，但無顯著差異，且仍顯著低于安靜對照組（P < 0.05）。

表3 3組大鼠CD3+細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+比值比較

2.2.2 IFN-γ和IL-4

如表4所示，與安靜對照組相比，過度訓(xùn)練組大鼠Th1型特征性細(xì)胞因子IFN-和Th2型特征性細(xì)胞因子IL-4均顯著增加（P < 0.01），IFN-/IL-4比值顯著降低（P < 0.05），表明過度訓(xùn)練大鼠Th1/Th2失衡，向Th2方向漂移；而補充蒺藜提取物后過度訓(xùn)練大鼠IFN-水平顯著增加（P < 0.01），IL-4水平顯著降低（P < 0.01），IFN-/IL-4比值明顯升高，接近安靜對照組水平。

表4 3組大鼠IFN-和IL-4比較

表4 3組大鼠IFN-和IL-4比較

*P < 0.05，**P < 0.01：與安靜對照組比較；#P < 0.05，# #P <0.01：與過度訓(xùn)練組比較。

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2.2.3 NK、NKT細(xì)胞數(shù)

表5顯示，與過度訓(xùn)練組相比，蒺藜+過度訓(xùn)練組大鼠NK、NKT細(xì)胞均顯著增加（P < 0.05），NKT細(xì)胞數(shù)量顯著高于安靜對照組（P < 0.05）。

表5 3組大鼠NK、NKT細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

3.1 6周遞增負(fù)荷運動導(dǎo)致運動性免疫抑制模型的建立

大鼠運動性免疫抑制模型的成功建立是本研究的基礎(chǔ)。因此，我們首先檢驗6周遞增負(fù)荷運動后大鼠是否出現(xiàn)過度訓(xùn)練。本實驗結(jié)果表明，過度訓(xùn)練大鼠體重顯著降低，運動后期反應(yīng)遲鈍，精神萎靡不振，眼神暗淡無光，毛發(fā)脫落等，血漿T/C比值明顯下降，表明大鼠出現(xiàn)了過度訓(xùn)練；結(jié)合CD3+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量明顯減少、Th1/Th2失衡說明本實驗的運動方案成功建立了過度運動所致的運動性免疫抑制動物模型。

3.2 蒺藜提取物對過度訓(xùn)練大鼠免疫功能的影響

T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫反應(yīng)中有重要作用，T細(xì)胞數(shù)量增加和CD4+/CD8+比值升高反映免疫功能改善。本研究發(fā)現(xiàn)，與過度訓(xùn)練組比較，蒺藜+過度訓(xùn)練組大鼠CD4+/CD8+比值明顯增加，是安靜對照組的2倍左右，但CD3+T細(xì)胞數(shù)量僅有增加趨勢，無統(tǒng)計學(xué)意義，表明蒺藜提取物通過增加CD4+/CD8+比值增強(qiáng)過度訓(xùn)練大鼠的免疫功能。

Th1細(xì)胞主要負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞與體液免疫有關(guān)。IFN-、IL-4被認(rèn)為是Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的特征性因子，因此用IFN-/IL-4比值反映Th1/Th2平衡情況［5，6］。Mueller等發(fā)現(xiàn)重復(fù)性力竭運動可導(dǎo)致競技運動員IFN-下降，使Th1/Th2平衡向Th2漂移，導(dǎo)致免疫功能下降［7］。多個實驗室也得到了類似的結(jié)果［5，8，9］。目前認(rèn)為過度運動所致的運動性免疫抑制是因為過度運動抑制Th細(xì)胞向Th1分化，促進(jìn)其向Th2分化，使Th1/Th2平衡向Th2漂移，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能降低而體液免疫增強(qiáng)所致［5，8，9］。本研究顯示過度訓(xùn)練組大鼠IFN-/IL-4比值顯著降低，Th1/Th2平衡向Th2方向漂移，此與前人研究結(jié)果一致。而補充蒺藜提取物后過度訓(xùn)練大鼠IFN-/IL-4比值顯著上升，表明蒺藜可改善由于過度訓(xùn)練導(dǎo)致的Th1/Th2失衡，使其不向Th2方向漂移，促進(jìn)Th1/Th2恢復(fù)平衡。

NK細(xì)胞是具有自然殺傷能力的淋巴細(xì)胞，在機(jī)體免疫防御反應(yīng)中起重要作用。NKT細(xì)胞是特殊類型的T細(xì)胞亞群，其細(xì)胞表面既有T細(xì)胞受體，又有NK細(xì)胞受體。運動可導(dǎo)致免疫細(xì)胞發(fā)生數(shù)量及功能變化，而免疫細(xì)胞中以NK細(xì)胞變化最敏感，可以作為早期診斷運動性疲勞的監(jiān)測指標(biāo)［10，11］。NKT也是反映運動后免疫功能改變的較敏感指標(biāo)，受運動強(qiáng)度和運動量影響［12，13］。本研究發(fā)現(xiàn)補充蒺藜提取物可使大鼠NK、NKT細(xì)胞數(shù)量顯著增加，甚至超過安靜對照組水平，表明蒺藜提取物通過增加NK、NKT細(xì)胞數(shù)量改善過度運動大鼠免疫功能。增加的NKT細(xì)胞不僅有助于CD8+殺傷性T細(xì)胞的分化［14］，而且大大增強(qiáng)了NK細(xì)胞的殺傷活性［15］，提高機(jī)體免疫功能。

3.3 蒺藜提取物增強(qiáng)過度訓(xùn)練大鼠免疫功能的可能機(jī)制

作為免疫抑制劑的糖皮質(zhì)激素能促進(jìn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的凋亡，抑制炎癥因子的分泌，從而抑制免疫功能，而糖皮質(zhì)激素對運動中免疫功能的抑制作用也得到多篇文獻(xiàn)的證實。長時間大強(qiáng)度運動后出現(xiàn)的免疫抑制與糖皮質(zhì)激素的濃度升高有關(guān)［16］；糖皮質(zhì)激素的濃度與馬拉松運動員運動后1.5 h和3 h的循環(huán)淋巴細(xì)胞的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［17］；運動后增加的糖皮質(zhì)激素降低NK細(xì)胞的數(shù)量［18］以及降低踏車小鼠頜下淋巴結(jié)CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量［19］；次最大強(qiáng)度踏車運動所致的糖皮質(zhì)激素的增加與其促進(jìn)胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞的凋亡有關(guān)［20］；糖皮質(zhì)激素通過影響運動過程中的Th1/Th2不同細(xì)胞因子的分泌，使Th1/Th2失衡，向Th2漂移［21，22］等。以上結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素的升高至少是運動性免疫抑制發(fā)生的原因之一。本實驗發(fā)現(xiàn)與過度訓(xùn)練組大鼠相比，蒺藜＋過度訓(xùn)練組大鼠血漿皮質(zhì)酮水平明顯降低（約為過度訓(xùn)練組的50%），伴有免疫功能顯著增強(qiáng)；而過度訓(xùn)練大鼠血漿皮質(zhì)酮水平有升高的趨勢并伴有免疫功能降低，因此，推測蒺藜提取物對免疫功能的增強(qiáng)作用很可能與其降低皮質(zhì)酮水平有關(guān)。至于過度訓(xùn)練組大鼠的血漿皮質(zhì)酮水平?jīng)]有顯著增加的原因，可能與采血時間較晚（在運動后的第3天上午采血，約是運動后38小時），升高的血漿皮質(zhì)酮水平已有所恢復(fù)有關(guān)。

4 總結(jié)

蒺藜提取物增強(qiáng)過度訓(xùn)練大鼠受抑制的免疫功能，包括增加過度訓(xùn)練大鼠血漿CD4+/CD8+比值和NK、NKT細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)Th1/Th2失衡的改善，使其恢復(fù)平衡。蒺藜提取物對過度訓(xùn)練大鼠免疫功能的增強(qiáng)作用很可能與其降低血漿皮質(zhì)酮水平有關(guān)。

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