木質(zhì)素降解酶對(duì)纖維素酶水解糖化的抑制作用

馮 沖，陳 偉，杜風(fēng)光，宋安東

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002;2.河南天冠集團(tuán)，河南 南陽473000)

纖維質(zhì)原料中的骨架木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，纖維素因鑲嵌在由木質(zhì)素和半纖維素交聯(lián)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中而難以被纖維素酶水解，預(yù)處理是纖維質(zhì)原料改性及提高纖維素酶水解效率的關(guān)鍵技術(shù)［1］.自然界本身存在能夠降解木質(zhì)纖維素的微生物如真菌、放線菌和細(xì)菌，而真菌是其最重要的類型.一些白腐真菌能產(chǎn)生過氧化物酶(LiP)、錳依賴過氧化物酶(MnP)及漆酶(Lac)等3種木質(zhì)素降解酶，而大多數(shù)白腐真菌僅產(chǎn)生2種甚至1種木質(zhì)素降解酶［2，3］.目前國內(nèi)外研究最多、降解木質(zhì)素能力較強(qiáng)的白腐真菌是黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium).戴永鑫等［4］研究了白腐真菌及其產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶系對(duì)木質(zhì)素降解的方法，探討了黃孢原毛平革菌和雜色云芝單一菌株生物降解及雙菌株聯(lián)合降解木質(zhì)纖維素的規(guī)律.木質(zhì)素的降解主要通過多種胞外酶的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)［5］.這些酶之間也可能存在相互促進(jìn)或相互阻礙作用，從而影響相關(guān)處理效率，為揭示木質(zhì)素降解酶對(duì)纖維素酶水解糖化的影響，本研究利用2株對(duì)玉米秸稈木質(zhì)素具有較強(qiáng)降解能力的白腐真菌(黃孢原毛平革菌和雜色云芝)來探討白腐真菌預(yù)處理玉米秸稈對(duì)纖維素酶水解糖化的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試菌種為黃孢原毛平革菌和雜色云芝，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物能源工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種.

1.1.2 試劑和藥品 漆酶 (配制體積分?jǐn)?shù)1%的酶活力為104 U·mL－1)購自諾維信公司;木聚糖酶(酶活力為2×104U·mL－1)購自無錫杰能科生物工程有限公司;纖維素酶 (酶活力為400 U·mL－1)購自無錫星達(dá)酶制劑廠.

1.1.3 玉米秸稈粉 玉米秸稈清洗3遍，烘干(105 ℃，4 h以上)，粉碎(100目).

1.1.4 粗過氧化物酶液的制備 參見文獻(xiàn)［6］.

1.1.5 粗漆酶液制備 參見文獻(xiàn)［6］.

1.1.6 液相色譜條件 安捷倫1100，安捷倫碳水化合物 ZORBAX(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，保護(hù)柱 (150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)為75%乙腈，流速 1.0 mL·min－1，柱溫 30 ℃［7～10］.

1.2 方法

1.2.1 白腐真菌發(fā)酵酶液對(duì)纖維素酶水解糖化影響試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)照(CK):玉米秸稈與10 mmol·L－1pH值為4.5的乙酸 －乙酸納緩沖液按6∶1的液固質(zhì)量比混合，121 ℃，0.1 MPa高壓處理0.5 h，冷卻后補(bǔ)加緩沖液使液固質(zhì)量比為10∶1，纖維素酶水解.

A)粗過氧化物酶液的預(yù)處理:玉米秸稈與10 mmol·L－1pH值為4.5的乙酸－乙酸納緩沖液按6∶1的液固質(zhì)量比混合，121 ℃，0.1 MPa高壓處理0.5 h，冷卻后加入30 mL緩沖液和10 mL粗過氧化物酶液，45 ℃，140 r·min－1條件下處理 24 h，纖維素酶水解.

B)粗漆酶液預(yù)處理:玉米秸稈與10 mmol·L－1pH值為4.5乙酸－乙酸納緩沖液按6∶1的液固質(zhì)量比混合，121 ℃，0.1 MPa 高壓處理0.5 h，冷卻后加入30 mL緩沖液和10 mL粗漆酶液在45℃，140 r·min－1下處理 24 h，纖維素酶水解.

C)粗過氧化物酶液和粗漆酶液混合預(yù)處理:玉米秸稈與10 mmol·L－1pH值為4.5乙酸－乙酸納緩沖液按6∶1的液固質(zhì)量比混合，121℃，0.1 MPa高壓處理0.5 h，冷卻后加入20 mL緩沖液和V(粗過氧化物酶液)∶V(粗漆酶液)=1∶1的混合液 20 mL，在45 ℃，140 r·min－1條件下處理24 h，纖維素酶水解.

1.2.2 白腐真菌發(fā)酵酶液對(duì)纖維素酶水解微晶纖維素影響試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)照(CK):玉米秸稈不經(jīng)預(yù)處理直接用纖維素酶進(jìn)行水解.

A)粗過氧化物酶液預(yù)處理后酶解:加粗過氧化物酶液(1 mL·g－1)，45 ℃，140 r·min－1預(yù)處理24 h，加纖維素酶水解.

B)粗過氧化物酶液預(yù)處理滅活后酶解:加粗過氧化物酶液(1 mL·g－1)后滅活(沸水煮15 min)，45 ℃，140 r·min－1預(yù)處理24 h，加纖維素酶水解.

C)粗漆酶預(yù)處理后酶解:加粗漆酶(1 mL·g－1秸稈)，45 ℃，140 r·min－1預(yù)處理 24 h，加纖維素酶水解.

D)粗漆酶預(yù)處理滅活后酶解:加粗漆酶(1 mL·g－1)后滅活(沸水煮 15 min)，45 ℃，140 r·min－1預(yù)處理24 h，加纖維素酶水解.

1.2.3 Novozymes漆酶對(duì)纖維素濾紙酶活的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì) 不加漆酶(CK):加纖維素酶反應(yīng)60 min，測纖維素酶活性.

A)加漆酶:加漆酶0.5 mL，測定對(duì)纖維素濾紙酶活力的影響.

B)加滅活漆酶:加滅活漆酶0.5 mL，測定對(duì)纖維素濾紙酶活力的影響.

酶活性測定方法為:濾紙條 50 mg，0.1 mol·L－1HAC-NaAC(pH 值為 4.8)緩沖液 1.5 mL 和 0.5 mL稀釋酶液反應(yīng)60 min后加2 mL DNS.Novozymes漆酶，配制體積分?jǐn)?shù)0.5%，杰能科纖維素酶稀釋1 000倍測濾紙酶活.

1.2.4 Novozymes漆酶對(duì)纖維素酶水解糖化的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì) A)不加漆酶:纖維素酶直接水解糖化24 h.

B)加漆酶作用后不滅活:體積分?jǐn)?shù)1%漆酶45 ℃，140 r·min－1預(yù)處理0和24 h后，纖維素酶水解糖化.

C)加漆酶作用后滅活:體積分?jǐn)?shù)1%漆酶45℃，140 r·min－1預(yù)處理0 和24 h 后，滅酶(煮沸15 min)后，纖維素酶水解糖化.

1.2.5 Novozymes漆酶對(duì)纖維素酶水解微晶纖維素的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì) 不加漆酶(CK):直接加纖維素酶水解糖化，液相色譜測糖.

A)漆酶作用后不滅活:體積分?jǐn)?shù)1%的漆酶45 ℃，140 r·min－1預(yù)處理 24 h 后，加纖維素酶水解糖化，液相色譜測糖.

B)漆酶作用后滅活:體積分?jǐn)?shù)1%的漆酶45℃，140 r·min－1預(yù)處理24 h后，加熱煮沸 15 min滅活，滅活后加纖維素酶水解糖化，液相色譜測糖.

1.2.6 木質(zhì)素降解酶酶活的測定 參見文獻(xiàn)［11］.

1.2.7 纖維素酶水解糖化條件 按57 U·g－1秸稈添加，pH值為4.8檸檬酸緩沖液，在50℃，140 r·min－1條件下酶解 24 h.

1.2.8 還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 參見文獻(xiàn)［12］，其中，還原糖得率/%=還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)/底物(秸稈)質(zhì)量分?jǐn)?shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 白腐真菌發(fā)酵酶液對(duì)纖維素酶水解糖化的影響

從表1可以看出，粗過氧化物酶發(fā)酵液預(yù)處理玉米秸稈后，還原糖得率降低了40.3%;粗漆酶發(fā)酵液預(yù)處理后，還原糖得率降低了3.8%;混合酶發(fā)酵液預(yù)處理后，還原糖得率降低了27%.由此可知，白腐真菌發(fā)酵酶液預(yù)處理玉米秸稈后對(duì)纖維素酶水解糖化均有抑制作用，其中粗過氧化物酶發(fā)酵液影響最大，混合酶發(fā)酵液次之，粗漆酶發(fā)酵液影響最小.

2.2 白腐真菌發(fā)酵酶液對(duì)纖維素酶水解微晶纖維素的影響

從表2可以看出，粗過氧化物酶發(fā)酵液預(yù)處理玉米秸稈后，纖維素酶水解微晶纖維素所得葡萄糖質(zhì)量濃度降低了2.7%;滅活后，葡萄糖質(zhì)量濃度降低了2.3%.粗漆酶發(fā)酵液預(yù)處理后，葡萄糖質(zhì)量濃度降低了2.9%;滅活后，葡萄糖質(zhì)量濃度降低了1.5%.由此可知，粗過氧化物酶發(fā)酵液和粗漆酶發(fā)酵液預(yù)處理玉米秸稈后，對(duì)纖維素酶水解微晶纖維素均有抑制作用;滅活后，抑制作用減弱但沒有消除.

表1 白腐真菌發(fā)酵酶液對(duì)纖維素酶水解糖化的影響Table 1 The effect of white-rot fungus fermentation broth to cellulose enzyme hydrolysis saccharification

表2 白腐真菌發(fā)酵酶液對(duì)纖維素酶水解微晶纖維素的影響Table 2 The effect of white-rot fungus fermentation broth to cellulose enzyme hydrolysis microcrystalline cellulose

2.3 Novozymes漆酶對(duì)纖維素濾紙酶活性的影響

從表3可以看出，Novozymes漆酶使纖維素酶濾紙酶活性降低了80.6%;漆酶滅活后，酶活降低了3.2%.由此可知，Novozymes漆酶對(duì)纖維素酶濾紙酶活抑制作用明顯;滅活后，對(duì)纖維素酶濾紙酶活性的抑制作用大大減弱.

表3 Novozymes漆酶對(duì)纖維素濾紙酶活影響Table 3 The effect of Novozymes laccase on filter paper enzyme activity of cellulose

2.4 Novozymes漆酶對(duì)纖維素酶水解糖化的影響

從表4可以看出，Novozymes漆酶作用0 h后，還原糖得率降低了30%;漆酶滅活后，還原糖得率降低了28.3%.Novozymes漆酶作用24 h再糖化，還原糖得率降低了27.5%，漆酶滅活后，還原糖得率降低了15.8%.由此可知，Novozymes漆酶對(duì)纖維素酶水解糖化有明顯抑制作用.

2.5 Novozymes漆酶對(duì)纖維素酶水解微晶纖維素的影響

從表5可以看出，纖維素酶直接水解微晶纖維素所得葡萄糖糖質(zhì)量濃度為34.3 g·L－1;加入Novozymes漆酶后再水解，葡萄糖質(zhì)量濃度降低了72.0%;漆酶滅活后，葡萄糖質(zhì)量濃度降低了64.4%.由此可知，漆酶對(duì)纖維素酶水解微晶纖維素有明顯抑制作用，滅活后抑制作用有所減弱，但無法完全消除.

表5 Novozymes漆酶對(duì)微晶纖維素的糖化影響Table 5 The effect of Novozymes laccase on saccharification of microcrystalline cellulose

3 結(jié)論

1)白腐真菌(黃孢原毛平革菌、雜色云芝)發(fā)酵酶液預(yù)處理玉米秸稈后體系對(duì)纖維素酶水解糖化有抑制作用，酶滅活后抑制作用減弱.其中粗過氧化物酶液影響最大，混合酶液次之，粗漆酶最小.

2)2個(gè)菌種發(fā)酵酶液對(duì)纖維素酶水解微晶纖維素均有抑制作用，酶滅活后水解糖化均有所提高，但抑制作用依然存在.其中粗過氧化物酶液較粗漆酶影響大.

3)通過Novozymes漆酶一系列的試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了漆酶對(duì)纖維素酶水解糖化有較大的抑制作用.

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